Caracterización del proceso de translocación de poliprenol azúcares a través de membranas biológicas

La biogénesis de estructuras complejas que contienen hidratos de carbono como el lipopolisacárido (LPS), los exopolisacáridos, el peptidoglicano y los ácidos teicoicos en procariotas y las glicoproteínas en eucariotas se realiza generalmente a partir de precursores nucleótido-azúcares que transfieren sus restos de azúcares a poliprenoles como el undecaprenol y el dolicol (Dol). Los nucleótido azúcares se encuentran normalmente disponibles en el citoplasma, mientras que los poliprenoles están asociados con una bicapa lipídica.Una vez ensamblados, los azúcares unidos al poliprenol deben atravesar membranas para su posterior procesamiento (polimerización como en el caso del LPS o transferencia a proteínas como ocurre en la formación de glicoproteínas). Este proceso no ocurre espontaneamente y parece estar mediado por proteinas, aunque sólo para el pasaje a través de Ia membrana interna procariótica de las subunidades de antígeno O (el componente más variable del LPS) se ha identificado una proteína, denominada Wzx con actividad translocasa o “flipasa”. Las diferentes translocasas Wzx poseen una muy baja homología de secuencias tanto a nivel de DNA como de proteínas. Los intentos para sobreexpresar Wzx han sido infructuosos, lo que no ha permitido la realización de experimentos tendientes a caracterizar estructural y mecanísticamente a las translocasas. En este trabajo se investigó si es necesario que las subunidades O se sinteticen completamente para poder ser translocadas. Se obtuvo una mutante en el gen glf, responsable de la síntesis de galactofuranosa, el último de los cuatro azúcares que componen la subunidad O16 en Escherichia coli. Se observó que esta mutante es capaz de translocar una subunidad incompleta conteniendo sólo tres azúcares a través de la membrana. Experimentos utilizando la lectina del germen de trigo (WGA) permitieron establecer que también es posible translocar una subunidad truncada conteniendo sólo uno o dos residuos e incorporar estos azúcares al core del LPS. Experimentos de complementación realizados en una mutante de E. coli O7 en el gen wzx con translocasas de Salmonella enterica y E. coli O16 demostraron que la translocación de subunidades de antígeno O es independiente de la naturaleza química de la porción glicosídica de la subunidad O. Por el contrario las putativas translocasas involucradas en la síntesis de exopolisacáridos no fueron capaces de complementar la mutación en wzx. Los resultados presentados en esta Tesis indican que no se requiere que la subunidad O esté completa para que sea reconocida por la maquinaria de translocación y se produzca su pasaje a través de la membrana, pudiendo translocarse subunidades truncadas o completamente diferentes a las que normalmente se producen en una determinada cepa. Los resultados obtenidos sugieren además un modelo de biosíntesis de antígeno O que involucra el reconocimiento del prenol-oligosacárido por un hipotético complejo compuesto por la putativa translocasa Wzx y otras proteínas que participan en la síntesis de antígeno O