Análisis genético y bioquímico del metabolismo del poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en Bacillus megaterium

Las estrategias para poder clonar los genes involucrados en la síntesis, movilización o metabolismo del PHB en otras especies bacterianas abarcan 3 tipos: I) Complementación de cepas que no poseen actividad de alguna de las enzimas que intervienen en el camino biosintético del polímero. II) Hibridización de ácidos nucleicos utilizando sondas heterólogas de la zona conservada . III) Secuenciación directa de las proteínas de gránulo y construcción de sondas homólogas. Durante el desarrollo de mi tesis de investigación utilicé la estrategia de la secuenciación directa de las proteínas de gránulos. Para lograr esto era necesario saber que tipo de proteínas están asociadas al gránulo y comparar su patrón de corrida en PAGE con los patrones de corrida de otras especies y establecer cual era la probable PHB sintasa. El patrón de proteínas mostró 3 bandas intensas en el gel: una proteína de 22 kDa que cuyo extremo aminoterminal ya había sido secuenciado (Steinbüchel, dato no publicado). Está sería la proteína estructural de gránulo (fasina); las otras dos bandas son de proteínas de 40 kDa y 43 kDa. En cambio la proteína de 40 kDa, sería la PHB sintasa, debido a que se encuentra en gran cantidad el momento de recolección de las bacterias para analizar su patrón de proteínas, fue el de mayor acumulación de PHB. Por lo tanto procedí y logré el secuencimiento del extremo aminoterrninal de dicha proteína. Con las secuencias de las proteínas de 22 kDa y 40 kDa, diseñé dos sondas y con ellas realicé estudios de Southern tanto sobre ADN genómico como sobre plásmidos que contienen genes clonados de B. megaterium que intervienen en el metabolismo del PHB. Con estos experimentos se detectó un segmento de ADN cromosómico de B. megaterium que hibridaba con la sonda de fasina. Cuando se secuenció este fragmento se descubrió que contiene 3 genes que estuvieron involucrados en la transactivación de la Tiolasa II de E. coli. Dos de dichos genes mostraron, por comparación con secuencias proteínas y secuencias de ADN de los bancos de datos, que tenían una gran homología con un par de proteínas sensor-activador involucradas en la regulación del operón ato de E. col mediada por el complejo σ54 holoenzima RNA polimerasa. También mostraron una gran homología con otro activador de B. subtilis dependiente de σ54.El tercer gen mostraba homología con el gen pbt que codifica para la enzima Fosfobutiril transferasa (Pbt) en C. acetobutuylícum. Los análisis de la actividad enzimática de esta posible enzima Pbt de B. megaterium mostraron un patrón de expresión complejo: l) Sufre represión catabólica 2) Su pico de expresión se encuentra en el principio de la fase estacionaria 3) Se aumenta la expresión de este gen por la presencia de los aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Finalmente, mediante experimentos de expresión en E. coli, tanto de la enzima Pbt como del activador dependiente de σ54 clonados de B. megaterium, corroboré que dicho activador está involucrado en la transcripción del gen pbt