Estructura y función en las tiorredoxinas factores que determinan su especificidad por enzimas del ciclo de fijación de CO sub 2

Las Tiorredoxinas (Trx) son proteínas citoplasmáticas halladas en todos los sistemas biológicos, que catalizan con alta eficiencia la reducción de puentes disulfuro en otras proteínas por medio de un par de cisteínas en su centro activo. En los organismos fotosintéticos oxigénicos, la reducción mediada por Trxs modula la actividad de numerosas enzimas de las vías asimilativas. En el estroma de los cloroplastos se encuentran dos tipos de Trxs, filogenéticamente distantes: Trx-f, de linaje eucariótico, y Trx-m, emparentada con las Trxs bacterianas. La actividad de la Fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), una enzima clave del ciclo de fijación de CO2, es estimulada selectivamente por la Trx-f, mientras que la Trx-m resulta ineficaz. Para caracterizar los factores involucrados en la interacción entre la Trx-f y la cFBPasa, y para indagar en la relación entre estructura y función en las Trxs, se utilizó como modelo la Trx de Escherichia coli, ineficaz en la activación de la enzima, pero muy estudiada funcional y estructuralmente, y se siguió una estrategia de mutagénesis dirigida. Un aspecto considerado fue la contribución de las cargas superficiales, ya que las interacciones electrostáticas son importantes para la afinidad entre proteínas. La introducción de cargas positivas alrededor del centro activo de la Trx de E.coli, sin modificar la estructura o la capacidad de reducción, aumentó considerablemente la capacidad de activar la enzima. Con altas concentraciones salinas en el medio, la afinidad de todas las Trxs por la enzima resultó similar, lo que corrobora la importancia de las interacciones electrostáticas. Las cisteínas reactivas de la cFBPasa se encuentran, de hecho, en una zona cargada negativamente, y regiones de carga negativa rodean el centro activo de la Trx-m y de E.coli, mientras que en la Trx-f la contribución de cargas positivas es mayor. Ciertas posiciones cercanas al centro activo, de importancia estructural en las Trxs, se han conservado estrictamente. Sin embargo. las Trx-f presentan desviaciones únicas. Se reemplazaron sucesivamente los residuos en la zona hasta alcanzar la secuencia encontrada en las Trx-f. Los cambios alteraron la conformación de un residuo triptofano conservado, y llevaron a una disminución tanto en la estabilidad estructural de las proteínas como en la capacidad reductora, que afectó a la activación de la enzima. La conformación de la zona inmediata al centro activo y la capacidad reductora son pues importantes para la activación de la enzima. En las Trx-f se deben dar cambios que permitan compensar los cambios, pero el significado funcional de los mismos permanece oscuro. Se aisló la secuencla codificante para la Trx-f de colza (Brassica napus), y la proteína se sobreexpresó y purificó. Si bien son potentes activadores de la cFBPasa, las Trx-f son pobres reductoras de puentes disulfuro en otras proteínas, y tampoco muestran una mayor actividad en la isomerización estos enlaces, lo que demuestra que el componente cinético es fundamental en la interacción con la enzima. Estos resultados sugieren que las interacciones electrostáticas y los aspectos conformacionales juegan un papel preponderante en la interacción entre las Trxs y (algunas de) sus proteínas sustrato, y que en los cloroplastos este factor podría determinar la especialización funcional de ambos tipos de Trx. Sin embargo, el significado fisiológico de la presencia de dos Trxs diferentes es aún esquivo