Mecanismos involucrados en la adquisición de la hormono-independncia : interacción entre receptores de progesterona y otras vías de señalización

En este trabajo de Tesis se evaluaron las siguientes hipótesis: 1. El receptor de progesterona (RP) está involucradoen el crecimiento tumoral progestágeno-independiente (PI). 2. Vias preliferativas activadas por factores de crecimiento activan al RP. 3. Factores del estrema tumoral participan en la transición hacia la hormono-independencia activando RP. 4. Los receptores de estrógenos alfa (REα) tienen un rol en el crecimiento tumoral pregestágeno-dependiente (PD). Los ensayos se realizaron en un modelo experimental de inducción de cáncer de mama por administración prolongada de acetato de medroxiprogesterona (MPA) en ratones hembras vírgenes de la cepa BALB/c. Los tumores utilizados fueron todos carcinomas ductales metastáticos con alto contenido de RE y RP, que se comportan como hormono-dependientes en los primeros pasajes subcutáneos singeneicos, creciendo sólo en presencia de progestágenos. En pasajes sucesivos pueden adquirir un fenotipo progestágeno-independiente, independizándose del requerimiento de hormonas, pero aún así mantienen la expresión de RE y RP. Un estudio de comportamiento de una serie de tumores PI, nos condujo a subclasificarlos en respondedores (PI-R) o no respondedores (PI-NR) (Helguero y col. Breast Cancer Res and Treat 79: 379-390, 2003) de acuerdo a la sensibilidad in vivo para regresionar con el tratamiento a antiprogestágenos. Para evaluar si existen factores de crecimiento capaces de reemplazar a los progestágenos en la estimulación de la proliferación celular en cultivos primarios de un tumor PD, el CC4-HD, usamos al bFGF y bloqueamos el RP mediante el uso de antiprogestágenos (RU 486 y ZK 299) y mediante el uso de oligonucleótidos antisentido. En todos los casos el bloqueo del RP inhibió la proliferación celular inducida por MPA, factores séricos o bFGF, de manera específica. Resultados similares se obtuvieron utilizando cultivos primarios de 3 tumores PI diferentes: 59-2-HI, C7-2-HI y CC4-HI. Estudios de Mobility Gel Shift confirmaron que tanto el MPA como el bFGF pueden inducir la activación del RP en células en cultivo y que los mismos se encuentran constitutivamente activados en cultivos primarios de tumores PI. Por otra parte se demostró que in vivo la terapia con oligonucleótidos antisentido de RP fue capaz de inducir una inhibición del crecimiento tumoral. Los tumores de animales tratados mostraron una significativa reducción de células en fase proliferativa y en la expresión de RP. Se observó incremento de apoptosis sólo en un tumor en el cual el tratamiento indujo reducción de tamaño. Para evaluar la expresión del bFGF y los receptores (RFGF 1 al 4) en los tumores PD y PI procedimos a evaluar primero su expresión en distintos estadios del desarrollo de glándulas mamarias normales por inmunohistoquímica. Si bien la expresión de bFGF en la mama normal de ratón ya estaba reportada, nuestros estudios revelaron una regulación de la expresión en el desarrollo. Los 4 receptores también se expresan en las mamas normales y su expresión también está regulada en los distintos estadíos del desarrollo. Por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia no se detectaron diferencias evaluables de expresión de bFGF o de sus receptores entre tumores PD y PI-R; si bien se pudo determinar la marcación de bFGF predominantemente estromal y la de los receptores en el parénquima tumoral. Los RFGF 2 y 3 están ampliamente expresados con localización nuclear además de la convencional. Debido a que con la técnica inmunohistoquímica no se puede discriminar entre las distintas isoformas de bFGF, se hicieron estudios de Western blots para identificar la isofonna clásica de 16kDa. Se detectó una mayor expresión de esta isoforma cuando los tumores PD crecían en ausencia de progestágenos. Para poder evaluar mejor la contribución de las células epiteliales o los fibroblastos en la expresión de bFGF, separamos ambas poblaciones y se hicieron cultivos primarios. Observamos mayor expresión de bFGF en los fibroblastos estromales de tumores PI que en los de tumores PD. En su conjunto estos datos indicarían que el bFGF estromal podría contribuir a inducir la proliferación celular en tumores PI a través de la activación de RP. En co-cultivos de células epiteliales obtenidas de un tumor PD con fibroblastos estromales obtenidos de un tumor PD o de uno PI se demostró que ambos fibroblastos ejercían un efecto sinérgico de la proliferación celular y que este efecto era mayor con los fibroblastos PI. A la inversa, células epiteliales PI cultivadas con fibroblastos PD crecieron más lentamente que al cultivarlas con fibroblastos PI. En el primer capitlo concluímos que los tumores con fenotipo PD y los PI-R necesitan de un RP funcional para proliferar y que el estroma cumple una participación activa en el crecimiento tumoral. En el crecimiento PI-R, el bFGF junto con otros factores provenientes del estroma podría estar activando los RP presentes en el parénquima, contribuyendo al fenotipo PI. El estroma PI liberaría una mayor cantidad de factores en respuesta a señales del parénquima. En el segundo capítulo estudiamos la participación del RE en el crecimiento tumoral PD y para ello bloqueamos el REα con un antiestrógeno puro, el ICI 182.780 y oligonucleótidos antisentido de REα. Como resultado, en ambos casos obtuvimos una inhibición de la proliferación celular acompañada por una disminución de expresión de RP, sugiriendo que el REα participa en el crecimiento PD y que la alta expresión de RP pueda deberse a la presencia de RE activados. En el tercer y último capítulo estudiamos el efecto de dos SERMs, y del antiestrógeno puro ICI 182.780, utilizados en la clínica sobre el crecimiento de un tumor PD y sobre la síntesis de RP. El ICI 182.780, el tamoxifeno y el raloxifeno mostraron efectos inhibitorios per se en el crecimiento in vitro al igual que el 17-β—estradiol (E2) pero en mayores concentraciones. El raloxifeno indujo una estimulación de la proliferación en presencia de progestágenos. EI ICI 182.780 y el raloxifeno revirtieron el efecto inhibitorio del E2 mientras que el tamoxifeno fue inhibitorio. El ICI 182.780 disminuyó la síntesis de RP mientras que el tamoxifeno y el E2 los aumentaron y el raloxifeno no tuvo efectos significativos. Concluimos que el tamoxifeno tiene un efecto similar al observado en la clínica en nuestro modelo experimental inhibiendo el crecimiento tumoral y aumentando la expresión de RP. Estos resultados nos llevan a hipotetizar que el tamoxifeno pueda ejercer efectos inhibitorios por su efecto estrogénico leve más que por su acción antiestrogénica. En conjunto estos resultados: a) jerarquizan el rol del receptor de progesterona en el crecimiento de carcinomas mamarios, b) brindan al estroma un posible rol protagónico en la adquisición de la hormono-independencia y c) la similitud entre los efectos del tamoxifeno obtenidos en la clínica y en estos tumores son interesantes para validar aún más los dos ítems anteriores en cuanto a su relevancia clínica