Actividad inhibitoria de compuestos reactivos contra motivos Zn-fingers sobre la infección con arenavirus

Los virus de la familia Arenaviridae incluyen patógenos humanos causantes de severas fiebres hemorrágicas, como los virus Lassa (LASV)y Junín (JUNV). La proteína Z de los arenavirus, posee un motivo RING finger altamente conservado entre los distintos arenavirus, necesario para la interacción con proteínas celulares y virales, y por lo tanto es un punto de ataque ideal para la quimioterapia antiviral contra las fiebres hemorrágicas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la actividad inhibitoria de compuestos electrofílicos reactivos con motivos Zn fingers. provistos por el National Cancer Institute (USA), comprobar que Z es el blanco de acción de dichos compuestos y demostrar que su rol es esencial en el ciclo de multiplicación viral. Los compuestos, que incluyeron disulfuros alifáticos y aromáticos, derivados azoicos e hidrazidas fueron inicialmente evaluados por su capacidad inhibitoria sobre la infección de células Vero contra los arenavirus JUNV y Tacaribe (TCRV). De un total de 15 compuestos ensayados, 2 presentaron similar eficacia en sus propiedades antivirales y virucidas, 6 presentaron una actividad virucida superior a su efecto antiviral, 3 fueron estrictamente antivirales, 1 ejerció únicamente acción inactivante y 2 fueron inactivos. Los compuestos inactivantes mostraron ser efectivos también contra el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV), arenavirus prototipo de la familia. El análisis de los parámetros (tiempo y temperatura) que afectan la inactivación de JUNV y TCRV, demostró que la cinética de inactivación es rápida y que la reacción es dependiente de la temperatura, ya que no hubo inactivación del virus a 4°C. La interacción entre el virus y el compuesto inactivante lleva a un bloqueo del ciclo de multiplicación viral a nivel de la transcripción y replicación, ya que el mismo se adsorbe y penetra en las células con igual eficacia que el virus control, pero no se detecta RNA correspondiente a los genes N, GPC y Z, en los viriones inactivados. Este hecho se verificó por la ausencia total de síntesis de proteínas virales cuando se infectan células con virus inactivado. Sin embargo, los viriones inactivados mantienen la funcionalidad de las proteínas externas, ya que se observaron títulos comparables de anticuerpos neutralizantes en animales inoculados con viriones inactivados con respecto a los inoculados con JUNV y TCRV infecciosos, indicando así la preservación de la capacidad antigénica de las glicoproteínas luego del tratamiento inactivante. La acción diferencial de estos agentes sobre HSV-1 y los arenavirus confirma que la proteína Z de los arenavirus juega no sólo un rol regulatorio durante el ciclo viral, sino que tiene también importancia estructural, ya que los compuestos ejercen su acción tanto en la célula infectada, como directamente sobre el virión.Los resultados del estudio del efecto inhibitorio sobre la proteína Z purificada de LCMV y LASV, indicarían que los compuestos están dirigidos particularmente hacia la proteína Z de los arenavirus, interaccionando con ella y provocando su multimerización, con la consiguiente pérdida de funcionalidad y capacidad infectiva del virión. Por otro lado, se sabe que la infección con LCMV conduce a la recolalización de cuerpos nucleares de la proteína celular con homeodominios ricos en prolina (PRH) al citoplasma de la célula infectada. En células infectadas con LCMV se observó que el tratamiento con NSC20625 inhibe la replicación del RNA viral, sin afectar la transcripción del gen celular prh. Además, el tratamiento con NSC20625, no sólo inhibió la expresión de la proteína viral Z en las células infectadas con LCMV, sino que además revirtió el patrón de distribución de la proteína PRH al patrón de PRH observado en células normales. Por último, el compuesto azoico ANNB mostró un amplio rango de acción contra los arenavirus, ya que fue también inhibidor de la multiplicación de otras cepas de JUNV, asi como de TCRV, Pichinde y LCMV. El estudio del modo de acción antiviral manifestó que el ANNB afecta las etapas tardías del ciclo de multiplicación viral; esto se comprobó al observar que ni las etapas tempranas de adsorción e internalización viral, ni la síntesis y expresión de proteínas virales estaban afectadas. La producción de virus asociado a células está igualmente afectada que el virus extracelular, por lo que el ANNB estaría bloqueando el correcto ensamblado dentro de la célula. Estos resultados demuestran por primera vez que una proteína esencial para los arenavirus es el blanco de acción de compuestos que representan agentes antivirales promisorios contra estos patógenos, mostrando similar eficacia in vitro que la ribavirina, la única droga conocida que ha sido ensayada en los pacientes infectados con arenavirus