Morphogenesis of the mouse mammary gland: the role of metalloproteinases

La glándula mamaria se desarrolla por un proceso de ramificación. Muchos factores han sido implicados en la regulación de este proceso morfogenético. Previamente, en nuestro laboratorio se desarrollaron ratones transgénicos que sobreexpresan la metaloproteasa estromelisina-1 (Str-1) y se demostró que la misma tiene un efecto morfogenético. Sin embargo resta dilucidar si este efecto es específico de las metaloproteasas de matriz (MMPs) y cuál es la relación entre la actividad proteolítica, los factores de crecimiento polipeptídicos y agentes morfogenéticos. El objetivo de la primera parte de esta Tesis fue contestar esta pregunta. Utilizamos para ello un sistema de cultivo tridimensional de organoides primarios de glándula mamaria de ratón y la línea celular epitelial de mama SCp2. Nuestros resultados indican que la morfogénesis de organoides primarios cultivados en geles de colágeno tipo I en presencia de factores de crecimiento polipeptídicos requiere de actividad MMP para que la misma se lleve a cabo. Por otra parte, la Str-1 recombinante fue capaz de estimular el proceso morfogenético en ausencia de factores de crecimiento. La plasmina también logró estimular el desanollo de ramificaciones por parte de los organoides; sin embargo este proceso también fue MMP dependiente. Para discernir entre señales morfogenéticas y de proliferación utilizamos una línea celular que carece de epimorfina y establecimos que las MMP, como la epimorfina, son necesarias para la morfogénesis pero no para la proliferación celular. Por otra parte la epimorfina, a diferencia de los factores de crecimiento polipeptídicos, estimuló la producción de MMPs sin afectar el número celular. Habiendo encontrado que la epimorfina es un regulador local de la actividad proteolítica, en la segunda etapa de esta Tesis quisimos investigar cuál era el papel de las hormonas sistémicas estrógenos y progesterona en la proteólisis. La observación de que ratones transgénicos para la isoforma A del receptor de progesterona (ratones PR-A) presentan un fenotipo hiperplásico muy similar al observado en los transgénicos para Str-l sugeria que podría haber una regulación a este nivel. Utilizamos para esta segunda parte del trabajo ratones PR-A, ratones knock-out para el receptor de progesterona (PR) y controles. Análisis de componentes de la membrana basal como la laminina-5 y el colágeno IV revelaron que la misma era discontinua en áreas de morfología anormal en las glándulas mamarias de los ratones transgénicos. También se detectaron pérdidas en la marcación para colágeno III. Esto se asoció con un aumento de células positivas para PCNA, un indicador de la proliferación celular. Por otra parte la ovariectomia demostró que el fenotipo es reversible y por lo tanto dependiente de la acción hormonal. Análisis de actividad proteolítica en tejidos de animales transgénicos y knock-out demostraron que habría una correlación entre los niveles de gelatinasa A y el PR sólo en el caso de los ratones knock-out. Tratamientos hormonales, por otra parte, permitieron establecer que las vías del PR y el ER estarían involucradan en la activación de la gelatinasa A. Por último encontramos en experimentos preliminares una correlación entre los niveles de MTl-MMP y los de PR, lo cual sugeriría que en la glándula mamaria del ratón, como se ha demostrado en otros sistemas, esta metaloproteasa de membrana estaría asociada a la activación de la gelatinasa A. Nuestros resultados demuestran un papel crítico para las metaloproteasas en la morfogénesis de la glándula mamaria y establecen que no sólo factores locales como la epimorfina son capaces de regular la actividad proteolítica de la glándula mamaria; las hormonas sistémicas estrógeno y progesterona juegan un rol protagónico también.The mammary gland develops through a process called branching morphogenesis. Many factors have been implicated in the regulation of this morphogenetic process. Previously, we developed transgenic mice that overexpress the matrix metalloproteinase (MMP) stromelysin-1 (Str-1), and showed that it has a morphogenetic effect on the mammary gland. However, it still remains to be determined whether this effect is specific to MMPs, and what is the relationship between proteolytic activity, polypeptide growth factors and morphogenetic agents. The aim of the first part of this Thesis was to answer this question. To do so we used a three-dimensional culture system of primary mouse mammary organoids and the SCp2 mammary epithelial cell line. Our results indicate that branching morphogenesis of primary organoids in collagen I gels in the presence of polypeptide growth factors requires MMP activity. On the other hand recombinant stromelysin-1 was able to induce morphogenesis in the absence of growth factors. Plasmin also stimulated branching morphogenesis of primary organoids; this effect was also MMP dependent. To differentiate between signals for morphogenesis and proliferation, we used a mouse mammary epithelial cell line that lacks epimorphin and established that, like epimorphin, MMPs are required for morphogenesis but not proliferation. Moreover, epimorphin, in contrast to growth factors, increased the levels of MMPs without affecting cell number. Having found that epimorphin is a local regulator of proteolytic activity in the mammary gland, in the second part of this Thesis we looked into the role of the systemic horrnones estrogen and progesterone. The fact that transgenic mice for the A isoform of the progesterone receptor (PR-A mice) have a phenotype that is very similar to that found in Str-l transgenic mice suggested that this could be the case. Therefore, for this second set of experiments we used PR-A transgenic mice, knock-out mice for progesterone receptor (PR) and wild type mice. Analysis of components of the basement membrane such as laminin-5 and collagen IV revealed that it was discontinuous in areas where there was abnormal morphology in the mammary glands of transgenic mice. We also found alterations in the staining pattern of collagen III. This was associated with an increase in the number of cells positive for PCNA, an indicator of cell proliferation. On the other hand ovariectomy revealed that the phenotype was reversible and therefore dependent on signaling through PR. Analysis of proteolytic activity in tissues of transgenic and knock-our mice revealed that there was a correlation between the levels of PR and gelatinase A only in the mammary glands of knock-out mice. Hormonal treatments established that signaling through ER and PR is involved in the activation of gelatinase A. Finally we found in preliminary studies a correlation between the levels of PR and MT1-MMP, suggesting that in the mouse mammary gland, like in other systems, this membrane bound MMP would be involved in the activation of gelatinase A. Our results show a critical role for MMPs in mammary gland branching morphogenesis and establish that not only local factors such as epimorphin can regulate proteolytic activity in the mammary gland; estrogens and progesterone play a crucial role as well.Fil:Simian, Marina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina