Characterization of the larval tissue degradation process during the metamorphosis of the Medfly, Caratitis Capitata (Wiedemann)

Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más importantes responsables de la histolisis de tejidos larvales durante la transición larva-adulto de dípteros. Se han descrípto, por primera vez en los insectos, proteinasas lisosomales específicas de la histolisis y se ha correlacionado su actividad con la de otras enzimas degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en músculos y cuerpo graso. Los principales resultados obtenidos son: l. Se aisló una nueva aspartil-proteínasa de 43.000 daltons, específica de la histolisis, denominada EMAP (Early metamorphosis aspartyl proteinase), con características bioquímicas similares al grupo de las Catepsinas tipo D y cuya secuencia amino terminal no presentó homología con este grupo. Usando la secuencia correspondiente al N- terminal se obtuvo un transcripto que fue clonado y secuenciado. La secuencia obtenida mostró homología del 59% con catepsina D de porcino, 51% con una proteinasa aspártica de mosquito y 60% con una proteinasa aspártica de arroz. 2. Se aislaron dos nuevas cisteín proteínasas lisosomales denominadas MCP I y MCPII (metamorphosis cystein proteinase), de 32.000 y 67.000 daltons respectivamente. Ambas enzimas fueron caracterizadas bioquímicamente y sus extremos amino terminales secuenciados. MCP I mostró características bioquímicas similares y alta homología N-terminal con las Catepsinas B de mamíferos (55.5%) y con una cisteín proteinasa de la mosca Sarcophaga (44%). MCP II es una endoproteinasa de nuevo tipo, cuyo N-terminal no presentó homología con ninguna cisteín proteinasa conocida en invenebrados, ni tampoco en vertebrados. 3. El perfil de actividad de las nuevas endopeptidasas coincidió con el de fosfatasa ácida, β-glucosidasa y β-galactosidasa lisosomales y correlacionó estrechamente con un marcado descenso en el contenido de proteínas registrado durante las etapas tempranas de la metamorfosis. El incremento en la actividad de enzimas lisosomales coincidió temporalmente (entre 20³º y 48 h desde la inmovilización definitiva de la larva) con la aparición de los primeros signos de muerte celular en los músculos y el cuerpo graso. 4. Es la primera vez que se describe en insectos el progreso temporal de la histolisis del cuerpo graso larval. Se determinó que la degradación de éste es un proceso gradual, que se inicia a las 20³ºh cuando las células que forman una red se separan unas de otras y finaliza alrededor de las 120 h cuando gran parte de las mismas se han fragmentado. Se determinó que los músculos esqueléticos correspondientes a los segmentos anteriores (l a 5) se fragmentan a partir de las 22 h, mientras que los correspondientes a la región abdominal, lo hacen recién a partir de las 72 h. 5. Se encontró una estrecha correlación entre la degradación del cuerpo graso larval y la depleción en el contenido de las principales moléculas de reserva. Cortes histológicos de cuerpo graso teñidos por PAS demostraron la completa desaparición del glucógeno en horarios posteriores a las 20³º h. El glucógeno fue consumido principalmente durante la etapa de salto y dispersión de la larva, mientras que el remanente (14% del contenido original, de acuerdo a dosaje directo) se consumió durante las primeras 20³ºh después de iniciada la metamorfosis. Los lípidos se consumieron principalmente a partir del estadio pupal (40 h), confirmando las imagenes histológicas obtenidas, donde se registró la disminución en el número y tamaño de las vesículas de grasa a partir de este horario Los resultados alcanzados han permitido obtener un panorama integral de la progresión de eventos degradativos durante la transición larva-adulto y mostraron por primera vez, que con muy pequeñas variantes, los eventos de la metamorfosis tienen idéntica duración relativa y representan etapas equivalentes del ciclo de vida en todos los insectos dípteros.We have studied in detail for the first time the most important molecular events involved in larval tissue degradation during dipteran larva to pupa transition. We have described for the first time in insect, specific lysosomal proteinases of the hystolitic process. We have also correlated these activities with other degradative enzymes and with the anatomic changes in muscles and fat body registered during metamorphosis. The most important results obtained are: l. We isolated a novel aspartic proteinase with a relative molecular weight of 43,000, called Early Metamorphosis Aspartic Proteinase, that is specific of hystolisis. EMAP presented similar biochemical characteristics to the Cathepsin D group, but the amino terminal sequence did not present homology with this group. Using the sequence corresponding to the N-terminal, we obtained a transcript which was cloned and sequenced. The sequence obtained showed a 59% homology to pork Cathepsin D, 51% to a mosquito aspartic proteinase and 60% to a rice aspartic proteinase. 2. We isolated two novel lysosomal cysteine proteinases denominated MCP I and MCP II (Metamorphosis Cysteine Proteinases), with 32,000 and 67,000 daltons respectively. The biochemical characterization of the enzymes and the amino terminal sequences were obtained. MCP I showed similar biochemical characteristics and high homology in the N-terminal sequence with mammalian Cathepsin B group (55.5%) and with the fly Sarcophaga cystein proteinase (44%). MCP II is a novel endopeptidase with an N-terminal sequence which neither presented homology with any cysteine proteinase of invertebrate nor with vertebrate. 3. The novel endopeptidase activity profile during metamorphosis was coincident and correlated well with the acid phosphatase, β-glucosidase and β-galactosidase activities profiles. Endopeptidase profile activity also correlated with the decrease in the amount of proteins registered during pre-pupal and pupal stages. The increment in lysosomal enzymes activities observed (from 20³º h to 48 h), were coincident with the appearance of the first symptoms of cell death in muscles and fat body. 4. As far as we know, this is the first time that larval fat body histolytic process was described in insect. It was determined that this is a gradual process, that begins at 20³º h when larval fat body cells dissociate from the typical mesh structure and ends 120 h after when most of the cells are fragmented. Larval muscles from 1ˢͭ to 5ͭʱ segment were fragmented 22 h from the beginning of metamorphosis. Muscles from the abdominal region fragmented since 72 h. 5. Temporal larval fat body degradation agreed well with the depletion of storage molecules. PAS histologic stain demonstrated the complete disappearance of glycogen in samples later than 20³º h. While the glycogen content decreased during larva III jumping and dispersal stage, the remaining 14 % remanent glycogen disappeared during the first 20³º h since the beginning of metamorphosis. Lipids were degradated since the beginning of the pupal stage (40 h), confirming the histologic images obtained, where a decrease in the number and size of lipids vesicles were registered since 40 h. The results reached in this Thesis have allowed us to obtain a complete view of the degradation events during larva-adult transition and showed for the first time, that with very little variations, the metamorphosis events have an identical relative duration and represent equivalent stages of the life cycle in all the dipteran insects.Fil:Rabossi, Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina