Actividad biológica de antígenos de Trypanosoma cruzi

De acuerdo a los objetivos planteados en este trabajo, hemos investigado la asociación entre componentes subcelulares del parásito con el gatillado y/o desarrollo del daño tisular en la forma crónica de la Enfermedad de Chagas. Nuestro primer paso fue investigar los componentes de la fracción CS responsables de la respuesta inmune humoral en los PChCr y en particular, identificar aquellos que pudieren ser reconocidos exclusivamente por los PChCr con cardiopatía severa. Para ello CS fue separada empleando geles de poliacrilamida, transferencia a hojas de nitrocelulosa y enfrentada con sueros de PChCr en distintos estadios clínicos. Estos estudios revelaron 32 componentes proteicos con PM entre 88 y 15 kDa, 30 de los cuales junto a 1 no visible por tinción para proteinas fueron reconocidos por al menos 1 de los 36 sueros ensayados, cada uno de los cuales reconoció entre 4 y 20 (media=12.6) bandas en CS. Si bien no pudo determinarse un perfil de reconocimiento particular para los PChCr con distinto compromiso clínico, se observó que el 75 % de los sueros reconocía 2 polipéptidos con PM aparente de 52 y 42/42 kDa. En un segundo momento intentamos una caracterización química inicial de las estructuras peptídicas antigénicas de CS y Mc. El tratamiento con ácido periódico disminuyó significativamente la reactividad de los sueros contra ambas fracciones, indicando el rol central de los carbohidratos en su antigenicidad. El tratamiento de CS con tripsina eliminó prácticamente toda la reactividad con los sueros de PChCr. El calentamiento y la reducción con 2 ME aunque también redujeron la capacidad total de unión de los anticuerpos hacia CS y Mc, el efecto fue más pronunciado para Mc. Sin embargo estos estudios revelaron que el antígeno calentado y reducido se resuelve en un mayor número de polipéptidos que el antígeno nativo, o solamente calentado o reducido. Con el objetivo de purificar antígenos relevantes se produjeron AcMo contra Mc. La reactividad anti-Mc y anti-CS de dichos AcMo fue evaluada empleando técnicas de ELISA, dot blotting (DB) e inmunoblotting (WB). Se seleccionaron así 45 hibridomas reactivos con Mc (28), Mc y CS (14) y CS (3). Entre los hibridomas productores de anticuerpos capaces de reconocer en Mc al menos un polipéptido con PM aparente mayor o igual a 50 kDa se seleccionaron 4 para su clonado. De estos 4 AcMo, todos del tipo IgM, fue posible aislar un total de 24 clones: 3 a partir del hibridoma 1A10, 12 a partir de 1D10, 2 a partir de 3C4 y 7 a partir de 2E9, la mayoría de los cuales se mostró reactivo con varios polipéptidos (3 a 9) en el mismo gel. Si bien el rendimiento de los procesos de clonado fue diverso, de 2 a 23 clones productores de AcMo reactivos con Mc según el hibridoma de partida, la eficacia del clonado fue buena: en 3 de los 4 casos fue posible identificar y aislar clones productores de Ac reactivos con polipéptidos del tamaño buscado, y en todos estos casos con reactividad más restringida que la del hibridoma original. A fin de investigar la presencia de determinantes antigénicos comunes al T. cruzi y a tejidos humanos se estudió la reactividad de los AcMo con muestras de tejidos humanos, obtenidas a partir de dadores cadavéricos no chagásicos, libres de enfermedades autoinmunes, coronarias y tumorales. Empleando ensayos de DB se estudió la reactividad anti-miocardio (MIO) y anti-músculo esquelético (MES) de 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS y 11 sobrenadantes negativos con ambas fracciones. En este primer estudio 27 de los 52 sobrenadantes de hibridomas reactivos con Mc y/o CS resultaron reactivos con MIO y/o MES. Con el propósito de establecer el perfil polipeptídico de MIO y MES humano ambos homogenatos fueron separados utilizando geles desnaturalizantes de poliacrilamida y transferidos a nitrocelulosa. Una porción de la misma se coloreó con Negro de Amido para evidenciar proteínas y la otra porción se aplicó a la determinación de glicoproteínas con Concanavalina A, para identificar residuos hidrocarbonados ricos en manosa y glucosa. MIO presentó 25 polipéptidos en el rango 79-15 kDa, 6 de los cuales contenían residuos azucarados, mientras MES reveló 24 bandas polipeptídicas, 7 de las cuales contenían hidratos de carbono. Una vez definido el perfil de MIO y MES se realizaron ensayos de WB para identificar los polipéptidos reconocidos por los AcMo en ellos. La fracción Mc es obtenida a partir de parásitos cultivados en un medio no definido que contiene homogeneizado de corazón bovino (TCM). Es entonces posible que componentes del medio de cultivo acompañen la purificación y hayan “ensuciado” la producción y selección de los AcMo, que así podrían incluir anticuerpos específicos para corazón bovino capaces de dar reacción cruzada con miocardio humano. A fin de investigar esta posibilidad se determinó en primer lugar la reactividad de dichos AcMo contra TCM y en aquellos casos donde esta fue encontrada se realizaron experimentos de absorción cuyos resultados demostraron que si bien para algunos AcMo existe reactividad cruzada entre Mc y TCM, la reactividad de los mismos hacia TCM es despreciable frente a la reactividad hacia Mc. Con el propósito de determinar no sólo la presencia sino también la localización subcelular de los antígenos de MIO y MES humano reconocidos por los AcMo anti-Mc se realizaron experimentos de inmunohistoquímica. Además se evaluó la especificidad de huésped y tejido empleando tejidos humanos y de hamster. En particular los AcMo ensayados (1A10C11, 1F3G2, 5A9B11 y 5F2) reconocieron estructuras en el MES humano y en MIO humano y de hamster. En todos los casos los AcMo se unen a antígenos intracitoplasmáticos, y en algunos casos (5A9B11 y 5F2) también a antígenos de la capa muscular de los vasos. El hecho de haber demostrado reactividad contra M10 de hamster dejó abierta la posibilidad de estudiar la actividad biológica de los mismos en modelos experimentales y por lo tanto consideramos importante estudiar el grado de homología entre los componentes del miocardio de distintos mamíferos. El perfil polipeptídico obtenido por la separación electroforética de homogenatos de MIO mostró un importante grado de homologia entre especies. Por otro lado la realización de ensayos de Inmunoiluorescencia sobre parásitos fijados mostró que los epitopos reconocidos por los AcMo, a pesar de pertenecer originalmente a una fracción interna del parásito, están también representados en la superficie y/o el flagelo del mismo. Otros estudios de caracterización de los AcMo anti-Mc revelaron que gran parte de los epitopos reconocidos por los mismos son al menos parcialmente de naturaleza glucídica. En particular entre los AcMo con reactividad cruzada dos (1A10C11 y 1F3G2) reconocen parcialmente epitopos de naturaleza glucídica mientras en los dos restantes (5A9B11 y 5F2) los residuos hidrocarbonados no forman parte del sitio reconocido. Para determinar si los epitopos con reactividad cruzada eran reconocidos por los PChCr y evaluar se ello tiene alguna importancia desde el punto de vista biológico, se realizaron ensayos de inhibición. La capacidad para inmunoinhibir la reacción del AcMo 5F2 con Mc fue significativamente mayor entre los sueros de PChCr que en los controles. Más aún, 5F2 fue capaz de diferenciar a la población de PChCr sin compromiso cardíaco, o con grado mínimo, de la de PChCr con compromiso cardiaco. Es también interesante destacar que la capacidad para inmunoinhibir la reacción de 5F2 resultó entre sueros de PChCr sin compromiso cardíaco directamente proporcional a la edad de los pacientes. El AcMo 5A9B11 también fue capaz de separar la población de PChCr de la de los controles. Más aún, los epitopos del 5A9B11 fueron reconocidos en distinta medida por los PChCr sin compromiso cardiaco, definiendose dos poblaciones con baja y alta capacidad de inmunoinhibición respectivamente. Por último, y atendiendo al rol central que las citoquinas y las moléculas de adhesión celular tienen en la modulación de la respuesta inmune, tanto en su faz protectora como en su potencial faz autoagresiva, en este trabajo estudiamos la cinética de expresión endógena de genes para citoquinas e ICAM-1 en células de bazo (B) y corazón (C) de ratones infectados con las cepas Tulahuén y CA-1 del parásito. Luego de obtener el ARN y ADNc a partir de homogenatos de B y C se realizaron ensayos de PCR cuali y cuantitativo usando "primers" y/o competidores específicos para IFN γ, TNF α, IL α, IL-6 e ICAM-1, encontrándose que la infección por el parásito va acompañada por un claro aumento en los niveles intracelulares de precursores para citoquinas e ICAM-1, aunque la cinética depende del órgano estudiado y de la naturaleza de los parásitos infectantes.Fil:Laucella, Susana Adriana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina