Biochemical and molecular characterization of the autocatalytic glycosyltransferase udp-glucose : protein transglucosylase

La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasa autocatalítica descripta tanto en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.) como en endosperma de maíz (Zea mays), involucrada en la síntesis de polisacáridos. Encontramos diferentes isoformas de UPTG de papa las cuales se expresaron en E. coli y se caracterizaron bioquímicamente. Las isoformas UPTG1 y UPTG2 no sólo presentan características cinéticas diferentes sino que además se expresan diferencialmente en los diversos tejidos de la planta. Se encontró una alta expresión de los transcriptos de UPTGl en estolones, tubérculos y raíces mientras que la expresión de los mensajeros de UPTG2 era elevada en todos los tejidos analizados, principalmente en hojas y tallos. El análisis del ADN genómico de papa sugiere la existencia de nuevas isoformas de UPTG, lo que sumado a la presencia de proteínas homólogas a la UPTG en otras especies vegetales, muestran que dichas glicosiltransferasas autocatalíticas constituirían una pequeña familia multigénica presente sólo en plantas superiores. Los estudios bioquímicos de la reacción de glicosilación de la UPTG mostraron que un único residuo de glucosa, xilosa o galactosa se une a la enzima en configuración β, con un tipo de unión que se comportaria más bien como las del tipo N. Además, el análisis de la reversibilidad de la reacción de glicosilación mostró que la UPTG catalizaría la ruptura del enlace glicosídico. El estudio de la naturaleza del inhibidor de la UPTG en maíz reveló que éste seria la isoforma SS1 de la sacarosa sintetasa presente principalmente en el endosperma. La isoforma SS1 ha sido relacionada recientemente con la biosíntesis de polisacáridos de pared celular y su asociación con la UPTG de maíz aporta una nueva evidencia a favor de dicha hipótesis. Los resultados de esta Tesis muestran que la UPTG de papa podía ser fosforilada in vitro. El tratamiento con fosfatasa de la proteína UPTG recombinante mostró que la defosforilación de la UPTG incrementa su glicosilación y que a su vez, la glicosilación de la enzima favorece la aparición de formas de mayor tamaño molecular inmunológicamente relacionadas con la UPTG. Se piensa que la defosforilación de UPTG incrementaría su glicosilación promoviendo la asociación de la proteína a otras proteínas o a sí misma. Se propone que la proteína UPTG se asociaría funcionalmente a elementos de anclaje, desconocidos hasta el momento, presentes en la membrana del Golgi facilitando el transporte de los UDP-azúcares sustratos de la biosíntesis de pectinas y hemicelulosas. Así, no podemos descartar que la defosforilación de la UPTG favorezca su asociación a membranas lo que podria involucrar un mecanismo de localización de la enzima. Los resultados con respecto al análisis de la expresión de ARNm de UPTG, sugieren que la enzima se expresaría principalmente en tejidos cuyas células estarían en estado de activo crecimiento y/o elongación. Basados en el hecho que en tejidos en elongación hay una activa síntesis principalmente de pectinas y hemicelulosas, los datos mostrados constituyen una fuerte evidencia que apoya la hipótesis que propone que la UPTG estaría involucrada en la síntesis de los polisacáridos no celulósicos que componen la pared celular vegetal. Más aún, la existencia de isoenzímas redundantes de UPTG sugiere que la enzima formaría pane de un sistema complejo esencial para la viabilidad de la célula vegetal.The enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase (UPTG) is an autocatalytic glycosyltransferase involved in the biosynthesis of polysaccharides, which was described in potato tubers (Solanum tuberosum L.) and in maize endosperm (Zea mays). We found at least two different UPTG isoforms from potato, we expressed the recombinant proteins in E. coli and their biochemical characteristics were determined. UPTG1 and UPTG2 isoforms not only showed different kinetic properties but also a differential mRNA expression in potato plants was observed. While UPTG1 expression was found predominantly in stolons, tubers and roots, UPTG2 expression was high in all the analyzed tissues but mainly in stems and leaves. The analysis of the potato genomic DNA suggested the existence of new isoforms of UPTG, what in addition to the presence of homologue UPTG proteins showed that these autocatalytic glycosyltransferases constitute a small multigenic family present only in higher plants. The biochemical analysis of the UPTG glycosylation reaction showed that only one residue of glucose, xylose or galactose was bound to the enzyme in β configuration and that the carbohydrate behaved like N-glycosidically linked. Furthermore, when we analyzed the reversibility of the glycosylation reaction we found that in the presence of UDP, the glycosidic bond between UPTG and glucose was broken. The nature of the UPTG inhibitor in maize was studied. We found that the SS1 isoform of sucrose synthase that is expressed predominantly in the endosperm, was responsible for UPTG inhibition. This isoform was recently related to cell wall polysaccharide biosynthesis and its association with UPTG provides a new evidence that supports this hypothesis. The Thesis work showed that the potato UPTG can be phosphorylated in vitro. After phosphatase treatment, an increase in UPTG glycosylation was observed. Furthermore, the enzyme glycosylation promotes the appearance of high molecular weight polypeptides, which are immunologically related to UPTG. We think that UPTG dephosphorylation could stimulate its glycosylation favoring its association with other proteins or with itself. We suggest that UPTG may functionally associates to anchoring elements, yet unknown, that are present in Golgi membranes facilitating the UDP-sugars transport from the cytosol for the synthesis of pectins and hemicelluloses. We cannot rule out that UPTG dephosphorylation could favor its association to membranes what may involve a localization mechanism of the enzyme. The results related to the expression of UPTG mRNA, suggested that the enzyme might be mainly expressed in actively growing or elongating tissues. The fact that in elongating tissues there is an active synthesis of pectins and hemicelluloses in addition to the results presented here, represent a strong evidence that supports the hypothesis that UPTG is involved in the synthesis of noncellulosic polysaccharides that constitute the plant cell wall. Moreover, the existence of redundant UPTG isozymes points out that the enzyme may form part of a complex system essential for the viability of the plant cell.Fil:Wald, Flavia A.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina