Structure and Function in Thioredoxins : Interaction with enzymes of the CO2 fixation cycle

Las Tiorredoxinas (Trx) son proteínas citoplasmáticas halladas en todos los sistemas biológicos, que catalizan con alta eficiencia la reducción de puentes disulfuro en otras proteínas por medio de un par de cisteínas en su centro activo. En los organismos fotosintéticos oxigénicos, la reducción mediada por Trxs modula la actividad de numerosas enzimas de las vías asimilativas. En el estroma de los cloroplastos se encuentran dos tipos de Trxs, filogenéticamente distantes: Trx-f, de linaje eucariótico, y Trx-m, emparentada con las Trxs bacterianas. La actividad de la Fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), una enzima clave del ciclo de fijación de CO2, es estimulada selectivamente por la Trx-f, mientras que la Trx-m resulta ineficaz. Para caracterizar los factores involucrados en la interacción entre la Trx-f y la cFBPasa, y para indagar en la relación entre estructura y función en las Trxs, se utilizó como modelo la Trx de Escherichia coli, ineficaz en la activación de la enzima, pero muy estudiada funcional y estructuralmente, y se siguió una estrategia de mutagénesis dirigida. Un aspecto considerado fue la contribución de las cargas superficiales, ya que las interacciones electrostáticas son importantes para la afinidad entre proteínas. La introducción de cargas positivas alrededor del centro activo de la Trx de E.coli, sin modificar la estructura o la capacidad de reducción, aumentó considerablemente la capacidad de activar la enzima. Con altas concentraciones salinas en el medio, la afinidad de todas las Trxs por la enzima resultó similar, lo que corrobora la importancia de las interacciones electrostáticas. Las cisteínas reactivas de la cFBPasa se encuentran, de hecho, en una zona cargada negativamente, y regiones de carga negativa rodean el centro activo de la Trx-m y de E.coli, mientras que en la Trx-f la contribución de cargas positivas es mayor. Ciertas posiciones cercanas al centro activo, de importancia estructural en las Trxs, se han conservado estrictamente. Sin embargo. las Trx-f presentan desviaciones únicas. Se reemplazaron sucesivamente los residuos en la zona hasta alcanzar la secuencia encontrada en las Trx-f. Los cambios alteraron la conformación de un residuo triptofano conservado, y llevaron a una disminución tanto en la estabilidad estructural de las proteínas como en la capacidad reductora, que afectó a la activación de la enzima. La conformación de la zona inmediata al centro activo y la capacidad reductora son pues importantes para la activación de la enzima. En las Trx-f se deben dar cambios que permitan compensar los cambios, pero el significado funcional de los mismos permanece oscuro. Se aisló la secuencla codificante para la Trx-f de colza (Brassica napus), y la proteína se sobreexpresó y purificó. Si bien son potentes activadores de la cFBPasa, las Trx-f son pobres reductoras de puentes disulfuro en otras proteínas, y tampoco muestran una mayor actividad en la isomerización estos enlaces, lo que demuestra que el componente cinético es fundamental en la interacción con la enzima. Estos resultados sugieren que las interacciones electrostáticas y los aspectos conformacionales juegan un papel preponderante en la interacción entre las Trxs y (algunas de) sus proteínas sustrato, y que en los cloroplastos este factor podría determinar la especialización funcional de ambos tipos de Trx. Sin embargo, el significado fisiológico de la presencia de dos Trxs diferentes es aún esquivo.Thioredoxins (Trx) are cytoplasmic proteins found in all living organisms. They efficiently catalyse the cleavage of disulfide bridges in other proteins through a pair of reactive cysteines in their active centre. In oxygenic photosynthetic organisms, Trx-mediated reduction modulates the activity of several assimilative enzymes. Two types of phylogenetically divergent Trxs coexist in the chloroplasts' stroma: Trx-f, of eukaryotic lineage, and Trx-m, akin to prokaryotic counterparts. The activity of Fructose-1,6-bisphosphatase (cFBPase), a key enzyme in the CO2 fixation cycle, is selectively stimulated by Trx-f, whereas Trx-m is inefficient. Escherichia coli Trx barely activates the enzyme, but instead is the most thoroughly studied Trx in both structure and function. Taking it as a model, we set out to characterise factors involved in the interaction between Trx-f and cFBPase, following a site-directed mutagenesis strategy. Surface charges are relevant features determining the association rate between proteins. Positive charges introduced around the active centre of E.coli Trx did not alter its structure nor its reductive capacity, but significantly enhanced its ability to activate the enzyme. At high salt concentrations, the affinity of all Trxs towards cFBPase converged to a limiting value, which stresses the importance of electrostatic interactions. Reactive cysteines in cFBPase are in fact included in a negatively charged region. Also, negative charges surround the active centre of E.coli and m type Trx, whereas in Trx-f there is a significant contribution from positive charges. In Trxs, several positions around the active site have been strictly conserved. Trx-f display however some peculiar deviations from consensus. Aminoacids were replaced so as to match the sequence found in Trx-f. Changes altered the conformation of a conserved tryptophan residue, and brought about a decrease in the structural stability of mutant proteins and in their reducing strength, damaging the activation of cFBPase. Conformation near the active centre, as well as reducing ability, are thus important for the activation of the enzyme. Compensatory shifts should take place in Trx-f, but their functional meaning, if any, remains obscure. Tha coding sequence of rapeseed (Brassica napus) Trx-f was determined, and the protein was overexpressed and purified. Though highly proficient in the activation of cFBPase, Trx-f are feeble in the reduction or isomerisation of disulfide bridges in other proteins. These facts suggest that there is a crucial kynetic component in the interaction with the enzyme. In brief, electrostatic interactions and the conformation of the active site seem to play a central role in the interaction between Trxs and (some of) its target proteins. This feature could be responsible for the functional specificity of both Trxs. Nonetheless, the physiological significance of two different Trxs in chloroplasts is still elusive.Fil:Mora García, Santiago. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina