Genetic markers linked to the coagulation factor VIII gene. : Their utility for molecular diagnosis in haemophilia a and for the study of the molecular mechanism of homologous recombination in human meiosis.

La hemofiliaA (HA)es una enfermedad hemorrágica hereditaria, ligada al sexo, causada por deficiencia del factor VIIIde coagulación (FVIII). La ruta preferida para la provisión de datos para diagnóstico molecular es la detección directa de mutaciones. Entre las mutaciones que afectan al gen del FVIII, la inversión del intrón 22 (inv22) constituye la causa de casi la mitad de las HA severas (SHA). Mediante análisis de Southern blot fueron estudiadas 47 familias Argentinas con SHA. En cercano acuerdo a lo reportado series internacionales, 19 de ellas (40%) resultaron informativas para la Inv22 y pudo proveerse diagnóstico molecular por el método directo. Dentro de éstas, 14 (79%) resultaron Inv22 tipo distal y las restantes 5 (21%), proximal. No fueron encontradas significativas asociaciones entre la presencia o no de la Inv22 en SHA, y el origen de la enfermedad (esporádica o familiar), ni tampoco con la propensión o no a desarrollar anticuerpo inhibidor neutralizante contra el FVIII terapéutico. El camino alternativo para el diagnóstico es por vía indirecta usando polimorfismos ligados a la enfermedad. Entre los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ubicados dentro del gen del FVIII, el marcador Xbal A del intrón 22 a pesar de proveer una alta informatividad en los distintos ganos étnicos analizados, fue casi excluido de la rutina diagnóstica por la lentitud y laboriosidad de su detección. Aquí se describen dos métodos rápidos, no-radioactivos, basados en PCR de larga distancia (LDPCR), para genotipificación del RFLP Xbal A. Los amplimeros de 6,6 y 6,9 kb incluyen el sitio polimórfico y un sitio constante de Xbal que provee control de digestión. La especificidad del método fue desafiada en experimentos a ciegas de muestras previamente genotipificadas por Southern blot, obteniéndose una perfecta correlación entre ambos métodos. Mediante este método, 53 cromosomas X de la población Argentina general fueron genotipificados para Xbal A, lo que permitió proyectar una informatividad de aproximadamente el 47%. Los estudios de asociaciones alélicas entre Xbal A (X) y el polimorfismo Bc/l (B) del intrón 18 del gen del FVIII, determinaron un alto, pero no-completo desequilibrio de ligamiento entre los marcadores, proyectando una informatividad combinada (X+B) del 55%. A 737 bp rio abajo del RFLP Xbal, fue localizado y caracterizado un nuevo polimorfismo bialélico, de cambio de nucleótido que afecta el sitio de reconocimiento de la enzima Mspl (CCg/aG). La genotipificación especifica del RFLP Mspl A se realiza utilizando la LD PCR específica para Xbal A como primera vuelta. seguida por una PCR anidada de 176 bp que incluye al sitio polimórfico y uno constante de Mspl para proveer control de digestión. Su análisis en las poblaciones nomiales Argentina y Británica permitió estimar una heterocigocidad de 49 y 46%, respectivamente. A pesar de su proximidad física y su desequilibrio de ligamiento, X y M proyectan una informatividad conjunta del 62% para población Argentina y 59% para la Británica. Ambos RFLPs (X y M) están incluídos en una región de 9,5 kb dentro del intrón 22 del gen del FVIII(int22h-1), que se encuentra repetida por lo menos 2 veces fuera del gen del FVIII, también sobre Xq28 (int22h-2 y -3). Para investigar los sitios correspondientes de X y M sobre los homólogos extragénicos fueron diseñados abordajes específicos similares a aquellos usados para los sitios intragénicos. Los sitios Mspl extragénicos (B y C) resultaron polimórficos en población Argentina y Británica aunque con frecuencias del alelo [+] mucho menores a las intragénicas. La Inv22 es originada por un evento de entrecruzamiento recíproco intracromosómico por recombinación homóloga entre las secuencias int22h descriptas resultando en la interrupción inactivante del gen del FVIII en su intrón 22. Debido a (1) que los marcadores X y M ubicados dentro de int22h permiten mediante sus frecuencias alélicas diferenciar las copias intra de las extragénicas y (2) que en el cromosoma X de varones de la población normal podemos estimar el estado de estos marcadores antes del evento y en los hemofílicos con la Inv22 podemos analizar el estado de estos marcadores después del evento; se diseño una estrategia para recabar datos del mecanismo molecular que origina la Inv22 como modelo de entrecruzamiento recíproco en meiosis humanas. La aplicación del método planteando nueve hipótesis de posibles intermediarios moleculares de la Inv22 asociadas a la predicción de resultados numéricos utilizando las estimaciones sobre población de varones normales y su comparación con los datos obtenidos en el grupo de afectados con la Inv22, permitió determinar que el evento molecular de recombinación meiótica está acoplado a la conversión génica del marcador Xbal, con la secuencia extragénica como dadora de la información. El mismo análisis sobre Mspl si bien proyecta resultados similares, no permite determinado con significación estadística. El aumento de la población hemofílica para la obtención de resultados más precisos además de los estudios de mapeo de puntos calientes para rupturas meióticas de doble cadena dentro de las secuencias int22h permitirá la elucidación específica del mecanismo de la Inv22 como modelo de recombinación homóloga en meiosis humanas.Haemophilia A (HA) is a sex linked inherited haemorragic disorder characterised by deficiency in the coagulation factor VIII (FVIII). Direct mutation detection in the gene is the best choice to obtain data for molecular diagnosis. Intron 22 FVIII gene inversion (Inv22) is involved in almost half of severe HA (SHA). It has been studied by Southern blot 47 Argentinean families with SHA and found inversions in 19 (40%), 15 (32%) with distal and 4 (8%) with proximal pattern. In this group of Inv22 informative families definitive information for molecular diagnosis could be provided. No significant correlation between the inheritance of the disease (either familiar or sporadic haemophilia) and the presence of inversions was found. The development of therapeutic-FVIII inhibitor in inv22-positive SHA-affected families was found increased but not significantly. The alternative route to obtain molecular information for genetic counselling is gene tracking using DNA polymorphisms. Among the restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) in the FVIII gene, the Xbal A (intron 22) (X) despite its high informativity in almost all ethnic groups analysed, has not been frequently used in the routine because its reliable detection is tedious and labour-intensive. Two rapid, non-radioactive, long distance PCR-based methods (LD PCR) to genotype the X RFLP are described. The amplimers of 6.6 and 6.9 kb long include both the polymorphic and a constant Xbal site, which provides a digestion control. The specificity of the method was challenged by a blind experiment with genomic DNA samples previously genotyped using Southern blot analysis: a perfect correlation was obtained using both approaches. Fifty-three alleles from the Argentinean normal population were Xbal A genotyped. The results predict an informativity of 47%. Despite the high degree of allelic associations found between X and Bc/l (intron 18) (B), they predicts a combined heterozygocity (X+B) of 55%. A new polymorphism in the human FVIII gene has been localised and characterised. It is a bi-allelic single nucleotide polymorphism which affects an Mspl site (CCg/aG)located 737 bp downstream frorn the Xbal marker. The specific genotyping of the so termed Mspl A RFLP (M) requires a nested PCR approach using the X-specific LD PCR as first round and a 176 bp-long second round which includes both the polymorphic and a constant control digestion Mspl site. M genotyping from the Argentinean and the British normal population estimate an informativityof 49 and 46%, respectively. Despite their close proximity, the X and M polymorphisms are not in complete linkage disequilibnum: haplotype analysis from Argentinean and British population predict a combined informativity (X+M)of 62 and 59%, respectively. The markers X and Mare located in intron 22 of the FVIII gene within a 9.5 kb int22h-1segment. Int22h is duplicated at least twice extragenically at Xq28. Both extragenic copies (int22h-2 and —3) are also polymorphic with respect to X. There have been designed LDPCR-based methods to specifically genotype these extragenic X and M sites. The extragenic sites of both X and M resulted also polymorphic in Argentinean and British normal populations but with much lower frequencies of the [+] allele than those obtained frorn int22h-1. Inv22 originates by an intrachromosomic crossing over due to homologous recombination between int22h-1 and int22h-2 or —3. The molecular inversion interrupts the normal sequence of the intron 22 of the FVIII gene causing SHA. Due to (1) X and M enable the discrimination of the intra from the extragenic copies of int22h by means of differences in their allelic frequencies, and (2) that there can be estimated these frequencies before the event in males from the normal population and the frequencies after the event in the Inv22-SHA population; it was possible to design an genetic testing strategy to address the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis. The inspection of the literature prompts the design of 9 possible hypothesis of the intermediaries of the mechanism involved. Each hypothesis was associated with numerical values calculated from the parameters estimated in the normal populations, to predict the results to be obtained from the Inv22-affected population. This analysis allowed us to conclude that the molecular inversion is coupled to the gene conversion from a DNA segment including the Xbal extragenic site to its intragenic homologue. The results obtained using Mspl, although similar than those using Xbal, are not statistically significant. The increase in the number of the haemophilic population in order to gain precision in the test and the investigation of meiotic double-strand-breaks hot spots within int22h would allow further insights in the molecular mechanism of the Inv22 as a model for homologous recombination in human meiosis.Fil:De Brasi, Carlos Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina