Caracterización molecular del Mal de Río Cuarto virus (MRCV) del maíz : estudio de los segmentos genómicos S1-S6, S8 y S10 y de las proteínas codificadas por los mismos

El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y tiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Las particulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa de proteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, se han reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus), el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentos genómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y características del serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentran repeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos los segmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formar estructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales de replicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidos deducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y se identificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Se determinó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contiene motivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a las codificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2 codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadas por el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de que la proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para una proteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología con miembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por los segmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con las proteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codifica para una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que es característico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadas por el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable función de helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable función sería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintos segmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evolución independiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitió proponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debe ser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no una raza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisis filogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas de todos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivos separados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otro agrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndose proteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fue capaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes en partículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteina correspondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En un experimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partícula viral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismo el antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteína de tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural del virus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconoció específicamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totales de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa que correspondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentes interaccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virus que causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo y al estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de una estrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en el desencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodes kuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interesting feature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and in many cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirus genome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fiji disease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequences of MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have the conserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In addition segment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identified immediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure of all segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined and stable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic protein that contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to other genera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which has and intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In this work we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein and has an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity to members of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5 codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function is unknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein contains an ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9 and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5 kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows a high identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. The comparative level of homology between different MRCV encoded proteins varied noticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based on phylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV, it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidic sequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed the existence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: one grouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second one grouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with an histidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able to specifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This protein corresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against the purified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed in bacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specifically detect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infected maize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maize plants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itself with a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNA dependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondent proteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within the genera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirus genus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maize plants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS).Fil:Distéfano, Ana Julia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina