Modulation of subcellular localization of nuclear factors by TPR proteins

Los dominios TPR están constituidos secuencias en tándem de 34 aminoácidos organizadas en α-hélices antiparalelas. Las proteínas TPR mejor caracterizadas son las que forman complejos con receptores de esteroides (REs) vía la heat-shock protein de 90-kDa, Hsp90, afectando su plegamiento y ensamblado. Nuestro laboratorio demostró que las inmunofilinas FKBP51 y FKBP52 son factores TPR que regulan antagónicamente la actividad transcripcional y localización subcelular de GR y MR. El objetivo de esta tesis fue estudiar el efecto de otras proteínas TPR como PP5, SGT1α y 14-3-3σ sobre GR y AR. Demostramos que PP5 favorece la retención nuclear de REs, 14-3-3σ retrasa la importación y acelera la exportación, mientras que SGT1α no afecta su distribución subcelular, aunque inhibe la actividad transcripcional de ambos receptores. En tal sentido, PP5 y 14-3-3σ muestran una respuesta bifásica, es decir, un aumento leve de la expresión estimula la transcripción, pero se inhibe con niveles más altos. Por ende, el balance de expresión de estos factores TPR debería afectar casos como el cáncer prostático en donde estas proteínas aumenta su expresión pudiendo potencialmente afectar el balance de actividad entre AR y GR, lo que influirá en el desarrollo y progresión de la patología. Al presente no existen drogas específicas para cada proteína TPR, por lo que realizamos un abordaje farmacológico que las afecte indirectamente usando como blanco a la chaperona Hsp90 con la que forman una unidad estructural y funcional. Estudiamos una serie de compuestos diseñados por modelado computacional como potenciales inhibidores de la actividad ATPasa de Hsp90, la que siempre se ha considerado clave para su función biológica. Algunos compuestos son bases de Schiff derivadas del 2,4-dihidroxibenzaldehido o del 5-cloro-2,4-dihidroxibenzaldehido, otros son derivados del resorcinol. Como control se usó geldanamicina, una benzoquinona ansamicina que es un conocido inhibidor de Hsp90. En contraste con el efecto de esta droga, la importación de REs no se vio afectada por las drogas sintéticas. No obstante, varias de ellas inhibieron la actividad de ATPasa de la chaperona y promovieron la pérdida de viabilidad de células tumorales prostáticas, mostrando en algunos casos efectos comparables al de geldanamicina. Ninguno de estos efectos guardó relación directa con la capacidad inhibitoria de ATPasa o la estructura química del compuesto. Nuestros resultados demuestran que tanto la localización subcelular como la actividad biológica de los REs se ve regulada por el balance de expresión de las proteínas TPR con las que interactúan. Además, se demuestra que, contrario al dogma dominante en la literatura, la actividad de ATPasa de Hsp90 no guarda correlación directa con tales efectos, a la vez que se describen nuevas drogas inhibitorias.TPR domains consist of tandem arrangements of 34 amino acids organized in antiparallel α-helices. The best characterized TPR proteins are those able to form complexes with steroid receptors (SRs) via the heat-shock protein of 90 kDa, Hsp90, affecting their folding and assembly. Our laboratory showed that the immunophilins FKBP51 and FKBP52 are TPR factors that regulate transcriptional activity and subcellular localization of GR and MR in an antagonistic fashion. The aim of this thesis was to study the effect of other TPR proteins such as PP5, SGT1α and 14-3-3σ on GR and AR action. We demonstrate that PP5 promotes nuclear retention of SRs, 14-3-3σ delayed both nuclear import and nuclear export rates of SRs, while SGT1α shows no affect on the receptor subcellular distribution. Nonetheless, SGT1α inhibits the transcriptional activity of both receptors. In this sense, PP5 and 14-3-3σ show biphasic response, that is, a slight increase in expression stimulates transcription, but transcription is inhibited by higher levels of expression. Therefore, the expression balance between these TPR factors should influence cases like prostate cancer, where the balance of activity between AR and GR affects the development and progression of the pathology. Because there are no specific drugs for each TPR protein, we performed a pharmacological approach to indirectly affect them using the Hsp90 chaperone partner as target.. We studied a series of compounds designed by computer modeling as potential inhibitors of the ATPase activity of Hsp90, which has always been considered key to the biological function of Hsp90. Some compounds are Schiff bases derived from 2,4-dihydroxybenzaldehyde and 5-chloro-2,4-dihydroxybenzaldehyde, others are resorcinol derivatives . Geldanamycin, a known benzoquinone ansamycin that inactivates Hsp90, was used as control. In contrast to geldanamycin, the import of SRs was not affected by the synthetic drugs. Nevertheless, they did affect tumor cell viability and inhibited the ATPase activity of the chaperone being as effective as geldanamycin itself. However, these effects were not directly related to their ATPase inhibitory activity. Our results demonstrate that both the subcellular localization and the biological activity of the SRs are regulated by the expression balance of their interacting TPR domain proteins. Furthermore, it is shown that the ATPase activity of Hsp90 is not directly related to these effects. A novel set of inhibitory compounds is also described.Fil:Mazaira, Gisela Ileana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina