Chloroplast thioredoxins

Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuencia muy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. En los cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividad proteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se han caracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-f presenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de la actividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gran solubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus características conformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx— m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sido ampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todas las Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Las interacciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en el reconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassica napus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectos estructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizados mostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli en la reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m es aún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a las cisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría del sitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen un rendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pH también es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es el residuo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también al espectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de la proteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólo las propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también la estabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo de esta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una carga positiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasa sujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador más eficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, que determinarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, las interacciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas las mutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estos resultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución de otros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada.Thioredoxins (Trxs) are found in all biological systems. They have a very conserved sequence Cys-Gly-Pro—Cys whose thiols reduce a wide array of protein disulfide bridges. In chloroplasts of oxygenic photosynthetic organism reduction carried out by Trxs modulate protein activity, as this process promotes conformational changes in proteins. In this organelle two phylogenetically divergent Trxs have been charaCterized: Trx—m of prokaryotic origin, while Trx—fdisplays great homology with human Trx. In vitro. Trx—fis particularly efficient modulating fructose—1,6-bisfosfatase (cFBPase) activity, whereas Trx—m is inefficient. The availability of Trx three-dimensional structures from different species, their small size, great solubility and termostability made them an interesting model for studying their Structure. One of the objectives of this thesis was to characterize Trx-m structurally and functionally, and compare it with Escherichiacoli Trx. Prokaryotic Trx was taken as reference since it has been extensively studied and has high identity with Trx-m. On the other hand, although all Trxs share the same catalytic mechanism (thiol—disulfide exchange), they interact with different proteins. Non covalent interactions prior to the formation of the disulfide mixed would determine the specificity of Trx by different substrates. In this context, electrostatic interactions in Trx-m/cFBPase recognition were analyzed. For these purposes the coding sequence of Brassica napus (rapeseed) Trx-m was determined, and the recombinant protein was overexpressed and purified. The study of functional and structural aspects was followed by a site-directed mutagenesis strategy. In spite of the great structural homology shared by Trx—mand E. coli Trx, almost all the studies carried out showed that they possess physicochemical and functional differences. Trx—m was less efficient than E. coli Trx in reduction and isomerization of disulfide bridges. On the other hand, although Trxs are very stable, our studies showed that Trxm is still more stable than prokaryotic Trx. W17F mutant of Trx—m conserves tryptophans near the catalitic cysteines. This mutant established that in spite of the fact that Trx-m and E. coli Trx maintain the geometry of the active site, the environment of these tryptophans is distinct. Both wild type Trx-m and Wl7F mutant have a lower quantum yield than prokaryotic protein and the intrinsic fluorescence in function of pH shows a different behavior. On the other hand, W17F mutant allowed us to identify that triptophan 17 in Trx-m is the residue that contributes more to the fluorescence emission of oxidized protein and also contributes to UV dicroism circular. The role of Trpl7 in the protein aromatic nucleus was determined replacing Trpl7 with a small and aliphatic residue (W17A). This mutant modified not only the structural properties (intrinsic fluorescence and UV circular dicroism) but also the stability towards physical and chemical perturbants. and reducing capacity (insulin and cFBPase). Proline in position 35 is strictly conserved in Trxs-m and absent in all the other. Replacement of proline enlarged the sensibility of the molecule to chemical and physical perturbants. Incorporation of a positive charge in that position (P35K) favored the interaction with cFBPase. while a negative charge impaired it (P35E). These results are congruent with the great negative density of charges that surround the redox regulating cysteins of cFBPase and the major positive charges that surround the active site of Trx—f,the more efficient modulator. On the other hand, high salt concentration conducted to all Trxs to similar values of activation. As conclusion, cFBPase would discriminate distinct Trxs by long—range electrostatic interactions. which would determine the different efficiency of Trxs in modulating enzyme activity. However, interactions would not influence interaction among Trx and malate dehydrogenase, since all mutants in Pr035 resulted less efficient in activation that wild type Trx—m.These results establish the participation of electrostatic interactions but also reveal the contribution of other factors in the formation of the non covalent complex (Trx-m)reduced/(substrate protein) oxidized.Fil:Duek, Paula Débora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina