La fibronectina como moduladora del fenotipo metastásico en líneas tumorales murinas

Los procesos de invasión tumoral y diseminación metastásica involucran tanto moléculas de adhesión como proteasas tumorales. Entre las moléculas de adhesión la fibronectina (FN), una glicoproteína de alto peso molecular presente en la matriz extracelular (ME) y en varios fluidos corporales, juega un importante rol en muchos aspectos de la interacción célula-célula y célula-sustrato incluyendo adhesión, spreading y migración, cicatrización y transformación maligna. El activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA) es una enzima proteolítica capaz de activar el sistema fibrinolítico por conversión del plasminógeno en plasmina e interviene en numerosos fenómenos de remodelación de matrices tisulares. Los tejidos cancerosos suelen contener un exceso de uPA, hecho que genera una intensa actividad degradativa en torno de la masa tumoral primaria. De esta manera, las células tumorales son capaces de degradar diferentes componentes de la matriz extracelular y migrar a través de estos defectos, constituyendo un paso crucial en el proceso de invasión y metástasis. En el presente trabajo se muestra el desarrollo de modelos de cáncer experimental útiles para estudiar el rol de las proteasas y los componentes de la ME en la biología de la progresión tumoral. En una primera instancia se establecieron y caracterizaron las líneas celulares LM3 y LMM3. obtenidas por subcultivos sucesivos in vitro a partir de cultivos primarios de los adenocarcinomas mamarios murinos M3 y MM3 respectivamente. Durante la evolución de la línea LM3 se observó un incremento en la capacidad de crecer en forma independiente del anclaje, un desplazamiento hacia un nivel triploide en la distribución del número cromosómico y la perdida gradual de la expresión de FN. La capacidad invasiva local y la capacidad metastásica espontánea de la línea LM3 se incrementaron con el aumento del número de repique, en asociación con la progresiva pérdida de expresión de FN y el incremento en los niveles de uPA unido a la membrana celular. Por otra parte, las células LMM3 mantuvieron la incapacidad para expresar FN y la alta capacidad metastásica espontánea ya observada en su tumor parental MMS, adquiriendo además una mayor invasividad local. Con el fin de analizar el rol de la FN en el proceso metastásico, células de la línea LMM3 se transfectaron en forma estable con distintas construcciones conteniendo variantes wt (salvaje) y RGD (-) del cDNA de FN humana y se obtuvieron, de esta manera, clones celulares capaces de re-expresar esta FN humana recombinante. Si bien ninguno de estos clones fue capaz de ensamblar una matriz extracelular in vitro, los mismos mostraron una reducción en su capacidad migratoria y un incremento en sus propiedades adhesivas. Todos los clones celulares analizados mostraron una reducción significativa en su potencial metastásico experimental cuando se los comparó con clones control y con la linea celular parental. Una tendencia similar se observó en la capacidad metastásica espontánea. Estos resultados indican que la re-expresión de FN, carente del sitio de unión a células RGD e incapaz de formar matriz extracelular. es suficiente para disminuir el potencial metastásico de las células tumorales. Además de tener un efecto directo en la adhesión y migración celular, la expresión de FN podría estar modulando otros eventos celulares asociados a la cascada metastásica. Con el fin de analizar esta hipótesis, se estudió el potencial angiogénico y la capacidad de producir uPA, una proteasa altamente correlacionada con el fenotipo invasivo, de los diferentes clones celulares. Independientemente de la integridad de la secuencia RGD, todos los clones transfectados con el gen de FN mostraron una reducción significativa en la capacidad angiogénica respecto del clon control, indicando que la FN podría prevenir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos, ya sea capturando o impidiendo la liberación de factores angiogénicos. Por otra parte, la re-expresión de FN produjo un incremento en los niveles de uPA secretados al medio condicionado en todos los clones analizados, si bien aquellos que expresan la variante RGD (-) secretaron un 50% menos de uPA que aquellos que expresan la variante wt. Por otro lado, los clones FNwt fueron incapaces de unir uPA a la superficie celular, mientras que los clones RGD (-), al igual que el clon control, conservan esta capacidad. El tratamiento de células LMM3 o del clon control con FN exógena indujo un aumento en la secreción de uPA y una caída en la capacidad de unir uPA a la membrana plasmática, en forma similar a los efectos inducidos por la re-expresión de FN en los clones. La modulación por FN de la actividad uPA secretada y asociada a la membrana celular mostró ser dependiente de la secuencia RGD y de la integrina β1. Estos resultados sugieren que la capacidad de la FN de bloquear el desarrollo de las metástasis en los clones celulares analizados puede también estar parcialmente generada por la disminución en la capacidad de unir uPA a la superficie celular mediada por la FN, generando la reducción de la capacidad migratoria e invasiva de las células. En la presente tesis se describe por primera vez un mecanismo por el cual la FN interviene en la prevención de la diseminación metastásica de manera independiente de la formación de ME y del principal sitio de unión a células, la secuencia RGD. Además, demostramos que la FN es capaz de modular la expresión de uPA y de su receptor uPAR. Por otra parte se sugiere la existencia de otros mecanismos que influyen en el potencial metastásico. En la presente tesis se proveen además nuevas evidencias acerca de cómo moléculas de la ME pueden modular el fenotipo metastásico.Tumor invasion and metastasis is a multistep process involving adhesion molecules as well as tumor proteases. In order to study the role of fibronectin (FN) in the metastatic process, we transfected a new cell line (LMM3), obtained in our laboratory by sequential subcultures in vitro, with two variants of a full length human FN cDNA. Besides affecting the adhesion and migration, we also analyzed if the reexpresion of FN may be somehow modulating the production of urokinase-type plasminogen activator (uPA), a protease highly correlated with the invasive phenotype. Our results showed that FN may prevent the metastatic dissemination independently of matrix formation and RGD sequence, the main cellular binding site. The results presented here strongly support a novel activity for the multifunctional glycoprotein FN regarding the regulation of uPA production as well as the capacity of tumor cells to bind uPA. We believe that the present report also provides a new insight on how ECM molecules like FN, may reduce the metastatic phenotype.Fil:Urtreger, Alejandro Jorge. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina