Biological and chemical features of the red seaweed gymnogongrus torulosus((hooker et Harvey)schmitz (phyllophoraceae, Rhodophyta)

Este trabajo de Tesis abarca cuatro temas principales: l- Aspectos biológicos del alga roja Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae, Rhodophyta). La ubicación taxonómica del material utilizado se basó en: (i) el análisis filogenético del gen rbcL para las especies del género; (ii) la formación de tetrasporofitos crustosos a partir de carposporas en cultivo. De acuerdo a las evidencias obtenidas, se postula tentativamente la transferencia de Gymnogongrus torulosus (Hooker et Harvey) Schmitz al género Ahnfeltiopsis. Además, se hizo un estudio de la morfología interna del talo por MO y MET. También, se determinó la ubicación de los polisacáridos sulfatados en el talo, encontrándose una distribución uniforme. A nivel de pared celular, se diferenciaron dos estratos: (i) una matriz fibrilar compuesta mayoritariamente por polisacáridos neutros y (ii) una matriz amorfa que se extiende a los espacios intercelulares, compuesta principalmente por pulisacáridos sulfatados. A su vez, se detectó por MET la presencia de una cutícula uniestratificada, “pit plugs” con “cap membranes", y vesículas asociadas al aparato de Golgi. Además, se observó la presencia de cloroplastos anómalos en células medulares. En este trabajo se cuestiona el valor taxonómico de la “inner cap layer" en la ultraestructura de las “pit plugs". 2- Análisis estructural del sistema de polisacáridos. Se estudiaron los extractos acuosos obtenidos a temperatura ambiente y a 90 °C. Los resultados obtenidos muestran la presencia de galactanos híbridos DL con: (l) estructuras mayoritarias de carragenanos de la familia kappa; (2) estructuras minoritarias de agaranos, formadas por un esqueleto de unidades altemantes de β-D-galactosa enlazadas por la posición 3 y unidades de ᵅ-L-galactosa enlazadas por la posición 4, con el siguiente esquema de sustitución: (i) sulfatación parcial en C-4 de la unidad ᵝ y, en las posiciones C-2 y C-3 o solamente en C-3 o C-6 de la unidad ᵅ; (ii) presencia de unidades de 3,6-anhidro- ᵅ-L-galactosa, en parte sulfatadas en C-2, reemplazando parcialmente las unidades de ᵅ-L-galactosa. La caracterización de todo el sistema de polisacáridos permitió estimar que la pared celular de esta alga roja presenta una relación carragenano:agarano ~2:l. La dispersión estructural que presentan estos galactanos sulfatados, plantea interrogantes sobre el significado quimiotaxonómico y filogenético de estos polisacáridos dentro de las algas rojas. 3- Dada la altenancia en la estructura de los carragenanos a lo largo del ciclo vital que presentan las algas rojas pertenecientes a las familias Phyllophoraceae y Gigartinaceae, se estudió la estructura química de los mismos en las fases reproductivas de Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae) y Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae) utilizando FT-IR, RMN ¹³C y métodos químicos de análisis. En base a los resultados obtenidos, se determinó que, para las algas estudiadas: (i) la biosíntesis de carragenanos no está directamente relacionada con el nivel de ploidía de las células que los producen; (ii) el cambio biosintético de carragenanos kappa a lambda (y de carragenanos lambda a kappa) se produce luego de la liberación y durante el desarrollo de las esporas (carposporas y tetrasporas) en las fases macroscópicas correspondientes (tetraspóricas y gametolïticas, respectivamente). 4- Actividad antiviral in vitro de los polisacáridos aislados y caracterizados de Gymnogongrus torulosus contra los virus herpes simplex (HSV-l y HSV-2) y virus dengue (DEN-2). Varias de las fracciones presentan: (i) alta actividad inhibitoria contra ambos tipos de virus, especialmente contra DEN-2. La misma estaría asociada con el bloqueo de la unión inicial virus-receptor celular, por parte de los polisacáridos sulfatados en la etapa de adsorción viral; (ii) ausencia de citotoxicidad para células Vero; (iii) baja o nula actividad anticoagulante. Las fracciones que están compuestas por estructuras mayoritarias de carragenanos son las que presentan una gran actividad antiviral. Por esta razón, la actividad inhibitoria estaría relacionada, al menos en parte, con la sulfatación en C-4 de las unidades B-D-galactosa y en C-2 de las unidades de 3,6-anhidro-ᵅ-D-galactosa. Estas características convierten a estos polisacáridos sulfatados en potenciales antivirales de aplicación tópica para los virus ensayados. Este trabajo presenta dos aspectos importantes a ser remarcados: (l) es la primera vez que se caracteriza un galactano híbrido DL desde el punto de vista de la actividad antiviral; (2) es el primero donde se evalúa la actividad antiviral de polisacáridos de algas rojas contra el virus del dengue (DEN-2).This Thesis focuses on four major topics: l. Biological features of the red seaweed Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae, Rhodophyta). The taxonomic identification of this material was based on: (i) phylogenetic analysis of rbcL gene for the species of the genera; (ii) development of the carpospores into crustose tetrasporophytes in culture. According to the evidences obtained, it is postulated tentatively that the red seaweed Gymnogongus torulosus (Hooker et Harvey) Schmitz should be transferred to the genera Ahnfeltiopsis. In addition, the internal morphology of the thallus was analyzed using LM y TEM. The sulphated polysaccharides were characterized all over the thallus, showing a homogeneous distribution. Two strata can be distinguished in the cell wall: (i) a fibrillar matrix, composed principally by neutral polysaccharides, and (ii) an amorphous matrix. extended to the intercellular spaces, composed mainly by sulphated polysaccharides. At the same time. a single-stratified cuticle, pit plugs with cap membrane, vesicles associated to the Golgi body were found by TEM. Also, anomalous chloroplasts were detected in medullar cells. In this work, the taxonomic significance of the inner cap layer on the pit plug fine structure is questioned. 2. Structural analysis of the polysaccharide system. The extracts obtained with water at room temperature and at 90 °C were studied. The results obtained show the presence of DL-galactan hybrids with: (l) carrageenans of the kappa family as major structures; (2) minor structures of agarans, built up mainly by a backbone of alternating 3-linked ᵝ-D-galactose and 4-linked ᵅ-L-galactose units, with the following substitution pattern: (i) partial sulfation on C-4 of the ᵝ-unit and on C-2 and C-3, or only on C-3, or C-6 of the ᵅ-unit; (ii) presence of 4-linked 3.6-anhydro-ᵅ-L-galactose, partially sulphated on C-2, replacing the ᵅ-L-galactose units. The whole cell wall polysaccharide system characterization allowed us to estimate a ratio of carrageenan: agaran of ~2:l for this red seaweed. The structural dispersion of these galactan sulphates, opens the question about chemotaxonomic and phylogenetic significance of these polysaccharides within the red seaweeds. 3. Based on the alternation of carrageenan structures during the life cycle of the red seaweeds belonging to Gigartinaceae y Phyllophoraceae, the chemical structure of these products was studied in the reproductive stages of Gymnogongrus torulosus (Phyllophoraceae) and Gigartina skottsbergii (Gigartinaceae) by FT-lR, ¹³C NMR and chemical methods of analysis. According to the results obtained, we concluded that for the seaweeds studied: (i) there is no direct relationship between the biosynthesis of carrageenans and the cell ploidy; (ii) the switch of kappa to lambda-carrageenan (and from lambda to kappa-carrageenan) happens after the dispersal and during the development of the spores (carpospores and tetraspores) into the macroscopic phases (tetrasporic y gametophytic phases, respectively). 4. In vitro antiviral activity of the isolated and well-characterized polysaccharides of Gymnogongrus torulosus against herpes simplex virus (llSV-l y HSV-2) and dengue virus (DEN-2). Several fractions show: (i) high inhibitory activity against both viruses, especially against DEN-2. It would be associated with the capacity of these sulfated polysaccharides to block the initial virus attachment to the cellular receptors on virus adsorption; (ii) lack of citotoxicity in Vero cells; (iii) low or lack of anticoagulant activity. The highest antiviral activity was observed in fractions composed mainly by carrageenan structures. Therefore, the inhibitory activity could be correlated with sulfation on C-4 of the ᵝ units and C-2 of the 3,6-anhydro-ᵅ-D-galactose units. These results indicate the relevance of these polysaccharides as potent antiviral agents, with promising perspectives of topical application for the viruses essayed. This work presents two remarkable aspects: (l) it is the first time that DL-galactan hybrids are characterized as antiviral agents; (2) dengue virus (DEN-2) is evaluated for the first time against this type of sulfated polysaccharides obtained from red seaweeds.Fil:Estevez, José Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina