Estudios moleculares sobre la UDP-GLC : Glicoproteína glucosiltransferasa : relación estructura-función

El retículo endoplasmático (RE)es el compartimiento subcelular involucrado en la síntesis, modificación post-traduccional y plegamiento de proteínas y glicoproteínas que serán destinadas a secreción, membrana plasmática o distintas organelas de los sistemas endocítico y exocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales más frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas. Numerosas proteínas son incapaces de alcanzar su conformación nativa sin la adición de N-oligosacáridos. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados proteicos son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia los complejos de Golgi se lleva a cabo exclusivamente cuando las proteínas se han plegado correctamente y se han ensamblado los multímeros. Este importante fenómeno, que asegura la integridad funcional de las proteínas que salen del RE,ha sido denominado "control de calidad". En el caso de las glicoproteínas, la estructura y el grado de procesamiento de sus N-oligosacáridos resulta ser una señal para la retención en el RE o el transporte hacia los complejos de Golgi. La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotas, con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol-P-P-oligosacárido), a cadenas polipeptídicas nacientes en el lumen del RE.Sin embargo la Glc no es un componente normal de las N-glicoproteínas maduras. Inmediatamente luego de la transferencia, los residuos de Glc son removidos por las glucosidasas I (GI) y II (GII). Los N-oligosacáridos libres de Glc son reglucosilados transitoriamente por la UDPG-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT)y deglucosilados posteriormente por la GII. De acuerdo al modelo actualmente aceptado, la calnexina (CNX), la calreticulina (CRT), la GII y la GT intervienen en el control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en el RE. A medida que las glicoproteínas van adquiriendo sus conformaciones nativas, alternan entre formas no glucosiladas y monoglucosiladas por efecto de las actividades catalíticas opuestas de la GII y de la GT. Las dos chaperonas moleculares no convencionales con propiedades de lectinas, CNX y CRT, que reconocen exclusivamente N-oligosacáridos monoglucosilados, unirían glicoproteínas en proceso de plegamiento o incorrectamente plegadas, reteniéndolas en el RE. Los ciclos de deglucosilación y reglucosilación continuarían hasta que el plegado correcto de las glicoproteínas se haya completado. Cuando las mismas adoptan su conformación nativa, se convertirían en sustrato de la GII, pero no de la GT, y se liberarían de las lectinas. Las glicoproteínas bien plegadas continuarían su camino por la vía secretoria hacia su destino mientras que las que se encuentran en proceso de plegamiento, serían retenidas en el RE y eventualmente translocadas al citoplasma para ser degradadas en el proteasoma. ' En este ciclo la GT funcionaría como un sensor del estado conformacional de las glicoproteínas, marcándolas o no con el residuo de Glc que determinará su unión a CNX o CRT. La GT fue purificada a homogeneidad a partir de Drosophila melanogaster,Rattus norvegicus y Schizosaccharomyces pombe,y demostró ser una proteína soluble del RE que depende de Ca2+ para su actividad y que utiliza UDP-Glc como dador de Glc. En cuanto a la glicoproteína aceptora, en un ensayo libre de células, ésta debe estar desnaturalizada para funcionar eficientemente como aceptor. La enzima reconoce el residuo más interno de GlcNAc de los N-oligosacáridos, y amino ácidos hidrofóbicos expuestos en las conformaciones no nativas de las glicoproteínas sustrato. Experimentos presentados en este trabajo de tesis demuestran que: (a) la GT de S. pombe es una enzima conformada por dos dominios: el dominio C-terminal (400 amino ácidos, altamente conservados entre GTS, 20% de la molécula), responsable de la interacción con UDP-Glc; y el dominio N-terminal (1100 amino ácidos, pobremente conservados entre GTs, 80% de la molécula) posiblemente responsable de la interacción de la GT con amino ácidos hidrofóbicos, confiriéndole a la enzima especificidad por glicoproteínas no totalmente plegadas. La unión entre ambos dominios se puede clivar proteolíticamente, pero ellos interaccionan a través de uniones no covalentes y no pueden separarse sin pérdida de la actividad enzimática. Esto explicaría el porqué la GT solo glucosila N-oligosacáridos muy cercanos al sitio mal plegado de la parte proteica (ver Discusión). Esta estructura de dos dominios está conservada desde levaduras a eucariotes superiores. (b) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a la GT de S. pombe, expresados separadamente en una misma célula S. pombe GT pueden formar una enzima activa y ser capaces de transferir Glc a glicoproteínas mal plegadas. (c) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a GTS de distintas especies, resultan ser intercambiables. (d) El dominio C-terminal correspondiente a la GT de S. pombe requiere la presencia del dominio N-terminal para plegarse correctamente y formar un complejo biológicamente activo, y/o para ser estable en el lumen del RE.The endoplasmic reticulum (ER)is the intracellular location responsible for post-translational modifications and proper folding of proteins bound for secretion, the plasma membrane or organelles of the endocytic system. N-glycosylation is one of the most frequent post-translational modifications and is related to protein folding, as many species are unable of properly fold without N-glycan addition. Folding intermediates, incompletely assembled oligomers, misfolded proteins and aggregates are selectively retained in the ER. Transport to Golgi compartments takes place only if proteins are in their native conformations and properly assembled. The mecanism that ensures the functionality of proteins that exit the ER, is the so called "quality control" (QC) of glycoprotein folding. For glycoproteins, the structure and processing degree of the N-oligosaccharides appeared to be a signal for the retention or transport to the Golgi complex. In most eukariotic cells, N-glycosylation is initiated upon oligosaccharide (Glc3Man9GlcNAc2)transfer from a lipid-carrier (dolichol diphosphate) to nascent proteins in the ER lumen. However, the Glc unit is not usually found in folded glycoproteins. The three Glc residues of the transferred oligosaccharide are immediately trimmed by two ER resident enzymes, glucosidases I and II (GII). The Glc-free N-linked oligosaccharides are then transiently reglucosylated by the UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (GT)and further deglucosylated by GII. According to a currently accepted model, calnexin (CNX), calreticulin (CRT), GII and GT are involved in the ER glycoprotein-specific folding and QC. As glycoproteins acquiere their native conformations, they switch between nonglucosylated and monoglucosylated forms by the opposing activities of GII and GT. CNX and CRT are lectins that specifically bind monoglucosylated high mannose-type oligosaccharides in newly synthesized glycoproteins. The lectin-monoglucosylated glycoprotein interaction retains not properly folded or assembled species in the ER. The deglucosylation and reglucosylation cycle continues until proper folding is achieved. Once glycoproteins have adopted their mature, fully folded conformations, they are no longer recognized by GT. Subsequent GII-mediated deglucosylation liberates them from their lectin anchors, thus allowing properly folded species to continue their maturation along the secretory pathway. In addition, the lectin-glycoprotein interaction enhances folding efficiency by preventing aggregation, premature' oligomerization and incorrect disulfide bond formation. GT is the key element of the QC mechanism as it is the only element discriminating between glycoprotein conformations. GT was purified to homogeneity from Drosophila melanogaster, Rattus norvegicus and Schizosaccharomyces pombe. The enzyme is a soluble ER protein that has an absolute requirement of millimolar Ca2+ concentrations for activity and uses UDPGlc as sugar donor. In cell-free assays GT glucosylates glycoproteins only if the Noligosaccharides are linked to a polypeptide backbone displaying a non-native conformation. It has been proposed that GT senses the exposure of hydrophobic regions normally buried in native conformations. GT sequence analysis suggests that it is composed of two domains, the N-terminal that comprises 80% of the molecule, has no homology to other known proteins and is presumably involved in recognition of non-native conformers and the C-terminal or catalytic domain that binds UDP-Glc homologs and displays a similar size and significant homology to members of glycosyltransferase family 8. Here we show that N- and C-terminal domains from either R. norvegicusor S. pombe GTS remained tightly but not covalently bound upon mild proteolytic treatment and could not be separated by a variety of different procedures without loss of enzymatic activity. Further, the notion of a two domain protein was reinforced by the synthesis of an active enzyme on transfection of S.pombe GT null mutants with two expression vectors, each of them encoding one of both domains. The tight association between N- and C-terminal domains may explain why N-glycans in the close proximity to protein structural perturbations are preferentially glucosylated by the enzyme. In spite of displaying practically no homology with S. pombe N-terminal domain (15.5-16.3%),the same portions from R. norvegicus and D. melanogaster enzymes linked to the C-terminal domain of yeast GT were functionally active when expressed in S. pombe thus indicating that all N-terminal domains share a common role. No functional enzyme was obtained on expression of the C-terminal domain, thus reinforcing the idea that the N-terminal domain is responsible for recognition of non-native conformers.Fil:Guerin, Marcelo Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina