Glicosilaciones no convencionales en protozoarios

Parte 1 El mecanismo de glicosilación de los residuos de asparagina de las proteinas es similar en todos los eucariotas: un oligosacárido preformado es transferido co-traduccionalmente a la proteína en el reticulo endoplasmático. Comienza entonces en dicha localización subcelular el procesamiento del mismo. Posteriormente en el aparato de Golgi continúa este proceso que habrá de conducir finalmente a la gran diversidad de oligosacáridos unidos N-glicosidicamente a las proteínas. Los tripanosomátidos son parásitos de considerable importancia médica y económica dado que existe una gran variedad de organismos (vertebrados, invertebrados y plantas) que pueden ser infectados por dichos parásitos. La N-glicosilación en tripanosomatidos presenta caracteristicas especiales como la existencia de moleculas de dolicol extremadamente cortas, la incapacidad de sintetizar oligosacaridos glucosilados unidos a dolicol-P-P, la presencia de oligosacariltransferasas que en sistemas libres de células catalizan la transferencia de oligosacáridos glucosilados y no glucosilados a la misma velocidad, el hecho de que ciertas especies solamente transfieran compuestos truncados (Man6GlcNAc2y Man7GlcNAc2) y, uno ó dos oligosacáridos (Man7GlcNAc2 y/o Man9GlcNAc2 simultáneamente) dependiendo del estadío de diferenciación, la adición de galactofuranosas a compuestos de alta manosa y finalmente la adición de ácido siálico a través de una trans-sialidasa y no por una enzima dependiente de CMP-siálico. En base a esto se decidió estudiar a dos tripanosomátidos con el objeto de determinar la presencia de otras caracteristicas distintivas. Por un lado se analizó a Blastocrithidia culicis, un tripanosomátido monogenético que vive en forma libre en el intestino de varias especies de mosquitos. Ese protozoario transfiere Man6GlcNAc en N-glicosilación. En el presente trabajo se encontró que los oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H, obtenidos a partir de glicoproteínas totales del parásito, contienen residuos de manosa, xilosa y ramnosa. La composición de alguno de ellos fue la siguiente: Man5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rha1Man5GlcNAc2, Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha2Man6GlcNAc2, Xyl1Rha3Man6GlcNAc2 y Xyl2Rha3Man6GlcNAc2. En oligosacáridos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H pero sensibles a N-glicanasa, se halló la presencia de unidades de manosa, xilosa, ramnosa y ribosa. Por el otro lado se analizaron las glicoproteinas de Endotrypanum schaudinni, tripanósomátido digenético que alterna su ciclo de vida entre un invertebrado y un vertebrado (perezoso). Se encontró que este parásito transfiere Man7GlcNAc2en la N-glicosilación de proteínas. Los oligosacáridos sensibles a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H se identificaron como Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Rib1Man6GlcNAc2 y/o Gal1Man6GlcNAcl Man5GlcNAc2 conteniendo dos residuos de ribosa ó galactosa ó uno de cada uno, Rib1Man5GlcNAc2 y Gal1Man5GlcNAc2. Las galactosas se hallan en configuración furanosa. Los glicopéptidos resistentes a endo-β-N-acetilglucosaminidasa H que fueron retenidos por concanavalina A-Sepharose y eluídos con α-metilmanósido contienen residuos de manosa, galactosa y ribosa. Es importante de mencionar que es la primera vez que se describe la presencia de residuos de ribosa en glicoconjugados de eucariotas, de residuos de ramnosa en oligosacáridos unidos a asparagina y de unidades de xilosa en compuestos del tipo de alta manosa. Finalmente, la presencia de galactofuranosas habia sido descripta en varias especies monogenéticas, pero tan sólo en un tripanosomátido digenético como Trypanosoma cruzi. Parte 2 En el presente trabajo se muestra, en membranas de Dictyostelium discoideum, la presencia de una actividad enzimática que transfiere N-acetilglucosamina-I-P, a partir de UDP-GlcNAc, a las proteinas en residuos de serina (UDP-GlcNAc: Ser-proteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa). Dicha actividad fue parcialmente purificada por cromatografia de afinidad en concanavalina A-Sepharose y por cromatografia de intercambio iónico en una columna de Mono Q. La enzima mostró una absoluta dependencia de cationes divalentes, siendo el Mn++ más efectivo que el Mgˉˉ. Posee un amplio rango de pH óptimo (6.5-9.0). El Km para el UDP-GlcNAc fite de 18 μM. En ensayos libres de células se utilizaron como sustratos exógenos apomucina y tiroglobulina nativa ó desnaturalizada, mientras que proteínas como la sero albúmina bovina y la uteroferrina nativa o desnaturalizada no mostraron capacidad aceptora para dicha actividad. A partir de un cultivo de células realizado en presencia de [³²P]fosfato se aislaron proteínas celulares (solubles y de membrana) y del medio de cultivo. En todas las fracciones se encontró la estructura de GlcNAc-1-P-Ser, sin embargo, la mayor proporción se halló en las proteinas secretadas. Al someter microsomas a centrifugaciones en gradientes de sacarosa , la actividad apareció en membranas de menor densidad al compararla con la actividad que fosforila oligosacáridos de alta manosa. Esto mostró que la actividad que fosforila residuos de serina en las proteinas (UDP-GlcNAc: Ser-proteina N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa) es diferente a la que fosforila oligosacáñdos del tipo de alta manosa unidos a las proteinas (UDP-GlcNAc: glicoproteína N-acetilglucosamina-I-fosfotransferasa).Fil:Merello, Silvana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina