Transcriptional regulation of alternative Splicing

En el presente trabajo de tesis investigamos aspectos relacionados con el acoplamiento entre la transcripción y el splicing alternativo. Utilizando como modelo al exón alternativo EDI de la fibronectina humana, encontramos que la elongación transcripcional es un importante modulador del splicing alternativo. El Ag T de SV40 activa la replicación del DNA 2 veces, la transcripción entre 12 y 20 veces, y es capaz de provocar un incremento de 25 veces en la inclusión del exón EDI. El efecto del Ag T es específico de exón, ocurre en cis y depende de la replicación del DNA y no de la transformación celular. VP16, un activador de la iniciación y elongación transcripcionales tiene un efecto similar en la transcripción pero opuesto sobre el splicing: inhibe la inclusión de EDI 35 veces. Es más, esta proteína viral es capaz de revertir el efecto del Ag T sobre el splicing de EDI. Consistentemente se determinó que la replicación es capaz de modificar la estructura cromatínica del molde y de ese modo alterar la capacidad elongadora de la RNA pol II. Por otro lado, el enhancer transcripcional del SV4O (una secuencia capaz de aumentar la capacidad elongadora de la RNA pol II) favorece la exclusión del exón EDI en forma independiente de los niveles de RNA. De este modo, la modulación de la capacidad elongadora de la RNA pol II aparece como una nueva forma de regular el splicing alternativo. Independientemente se determinaron dos hechos de importancia: ni el sitio intranuclear de transcripción, ni el reclutamiento de proteínas de splicing por la maquinaria transcripcional parecen tener una influencia importante sobre la decisión de inclusión del exón EDI en el transcripto maduro.In this work we investigated aspects related to the coupling between transcription and alternative splicing. Using the fibronectin alternative EDI exon as a model, we found that th pol II elongation rate has an important influence on alternative splicing. SV40 large T-antigen (T-Ag) activates template replication by only 2-fold, transcription by 12-20 fold and provokes a 25-fold increase in the inclusion of the EDI exon into mature mRNA. VP16, an activator of transcriptional initiation and elongation, has a similar effect on trasncription but the opposite effect on splicing: EDI inclusion is inhibited by 35-fold. Moreover, this Viral protein can revert the T-Ag effect. T-Ag- mediated replication can modify the chromatin structure of the plasmid DNA and, as a consecuence of this, can inhibit the processivity of RNA pol II. The SV40 enhancer (a sequence capable of changing the elongation rate of RNA pol II) stimulates EDI exon exclusion. Then, modulation of the elongation rate apperars as a key mechanism to regulate alternative splicing. In addition, we found that the intranuclear transcription site and the recruitment of splicing proteins by the transcription machinery are not important for the fate of EDI inclusion in mature mRNA.Fil:Kadener, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina