Immunomodulatory effects of neutrophil extracellular traps (NET)

La injuria pulmonar produce la liberación de ácido úrico que, a concentraciones locales elevadas, precipita formando cristales de urato monosódico (MSU). Estos cristales producen una considerable inflamación asociada a infiltración neutrofílica. Luego de la estimulación con MSU, los neutrófilos liberan trampas extracelulares (NETs), compuestas por cromatina y proteínas granulares, nucleares y citoplasmáticas asociadas. En este trabajo se estudió si las NETs inducidas por MSU (NETs-MSU), poseen propiedades inmunoregulatorias tanto sobre células epiteliales pulmonares como sobre otras células del sistema inmune innato como células dendríticas y macrófagos. Se observó que las NETs-MSU incrementaron significativamente la secreción de interleuquina (IL) 8 e IL-6 por células epiteliales pulmonares y bronquiales. Estos efectos no fueron reproducidos por sobrenadantes de neutrófilos estimulados con MSU en presencia de inhibidores de la netosis, como un inhibidor de elastasa o el inhibidor de la NADPH oxidasa DPI. Las NETs-MSU no afectaron la viabilidad de las células epiteliales, ni su morfología, como tampoco la integridad de la barrera epitelial formada por células epiteliales polarizadas. La capacidad estimulatoria de citoquinas de las NETs no fue afectada por la degradación del ADN con nucleasa micrococal, ni tampoco por el tratamiento de las mismas con heparina o cuando la actividad de la elastasa asociada a las NETs fue bloqueada con un inhibidor. Sin embargo, el efecto observado fue revertido al tratar a las NETs con un anticuerpo bloqueante de la proteína del grupo de alta movilidad (HMGB1). El efecto proinflamatorio de las NETs se observó también en macrófagos humanos derivados de monocitos pero no en células dendríticas derivadas de monocitos, indicando que las propiedades proinflamatorias de las NETs-MSU son específicas de ciertos tipos celulares. En conjunto, los resultados de esta tesis indican que las NETs inducidas por MSU inducen efectos proinflamatorios en células de las vías respiratorias, que podrían contribuir al reclutamiento de neutrófilos in vivo y a la perpetuación de la inflamación y al daño del tejido pulmonar. Nuestros hallazgos podrían ser relevantes para el tratamiento de enfermedades caracterizadas por una inflamación marcada del tracto respiratorio, como la fibrosis quística y el daño pulmonar agudo (ALI). En estas patologías, a pesar de haberse corroborado la presencia de grandes cantidades de NETs en el tracto respiratorio, el tratamiento con DNasas no logra resolver el cuadro inflamatorio. Los resultados de este trabajo de tesis, indicando que el tratamiento de las NETs con MNasa no reduce su capacidad proinflamatoria permiten especular que tratamientos tendientes a limitar la producción de las NETs o a bloquear a la molécula HMGB1, podrían representar opciones terapéuticas más apropiadas a fin de mitigar la inflamación que acompaña a estas patologías.Lung tissue injury leads to the release of uric acid which at high local concentrations forms monosodium urate crystals (MSU). These crystals trigger robust neutrophilic inflammation. Upon MSU stimulation, neutrophils release extracellular traps (NET) composed by chromatin and antimicrobial proteins associated. Here we investigated whether MSU-induced NET could be involved in the development of inflammation by stimulating cytokine release by airway epithelial cells and other relevant innate immune cells such as dendritic cells and macrophages. We found that MSU-induced NET significantly increased the secretion of IL-8 and IL-6 by lung and bronchial epithelial cells. These effects were not observed when NETosis was impaired by Diphenyleneiodonium or elastase inhibitor. Furthermore, NET did not affect the viability of airway epithelial cells, neither did they modify their morphology nor the barrier integrity of polarized cells. The epithelial stimulatory capacity of NET was not affected by degradation of DNA with micrococcal nuclease (MNase), treatment of NET with heparin or inhibition of the elastase immobilized to DNA, but was significantly reduced by pretreatment of NET with an anti-high mobility group box-1 blocking antibody (HMGB1). Additionally this proinflammatory effect was also observed in human monocyte- derived macrophages and not in human monocyte-derived dendritic cells. This indicates that the proinflammatory response is restricted to certain cell types. Altogether, our findings indicate that MSU-induced NET exert direct proinflammatory effects on airway epithelial cells that might contribute in vivo to further recruitment of neutrophils and perpetuation of inflammation upon lung tissue damage. These results could be relevant for treatment of pulmonary inflammatory pathologies, like cystic fibrosis and acute lung injury (ALI). Despite the fact that it has been proved the presence of large amounts of NET in these diseases, the current treatment with DNases does not resolve the associated inflammation. Our findings indicating that MNase treatment does not reduce the inflammatory capacity of NET suggest that treatments with NETosis inhibitors or HMGB1 blocking antibodies could be relevant therapeutics options to mitigate the inflammation in these pathologies.Fil:Sabbione, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina