Supramolecular systems organized by self-assembly of redox polymers and monomolecular layers of enzymes

Un biosensor constituye un dispositivo de reconocimiento molecular donde una macromolécula, generalmente de origen biológico interactúa con un analito en forma específica e inicia asi un proceso que se transduce en una señal eléctrica. Dentro de esta categoría podemos distinguir a los electrodos enzimáticos amperométricos, donde son medidos cambios de corriente eléctrica sobre un electrodo de trabajo a partir de variaciones en el estado rédox de un mediador que participa del proceso biocatalítico con la enzima rédox. La regeneración del estado rédox inicial del mediador sobre la superficie de un electrodo — aplicando potenciales apropiados — permite que se produzca un estado estacionario en la catálisis y por ende una corriente eléctrica también estacionaria. Este flujo de electrones se halla correlacionado en forma directa con el consumo del analito. El estudio de electrodos enzimáticos amperométricos ha estado tradicionalmente ligado a la inmovilización de las enzimas rédox en matrices poliméricas. Lamentablemente, estos sistemas integrados presentan dificultades para su estudio a escala molecular dadas por la complejidad y falta de control en la organización espacial del biosensor. Esto impide un análisis microscópico de las variables que afectan la respuesta de estos biosensores tales como el espesor, la concentración de enzima y mediador rédox o la cinética de reacción entre la enzima rédox y el mediador. La presente tesis propone una estrategia para el diseño de electrodos enzimáticos amperométricos para su utilización como biosensores. Esto involucra el empleo de técnicas de autoensamblado electrostático con el objetivo de depositar en forma altemada y secuencial la enzima rédox y el mediador. De esta manera es posible evaluar distintos parámetros de la película formada: la cantidad de enzima adsorbida, empleando la microbalanza de cuarzo (QCM); los sitios rédox depositados, por medio de técnicas electroquímicas; el espesor, mediante elipsometría y la morfología de la superficie, utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). Por otra parte, es evidente que el grado de control en el diseño del electrodo enzimático amperométrico permite analizar su respuesta en función de la estructura construida. En este contexto, se trabajó con dos enzimas rédox aniónicas: glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa de soja (SBP), mientras que se empleó polialilamina catiónica modificada con un complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+(PAH-Os) y un polielectrolito rédox globular de origen dendrítico, poliamidoamina modificada con el mismos complejo (PAMAM-Os) como mediadores rédox. En una primera etapa, se estudió el efecto de la estructura electrostática sobre la respuesta electroquímica de la PAH-Os. Dado que el film depositado es multi-bipolar, posee la propiedad de excluir iones por fuerzas electrostáticas repulsivas. En este sentido, el autoensamblado de PAH-Os con polielectrolitos aniónicos como poliestirensulfonato (PSS) y polivinilsulfonato (PVS) permitió elaborar un modelo de membrana permselectiva para analizar este comportamiento. Las cargas positivas - dadas por los grupos amino - y negativas — dadas por los grupos sulfonato - determinan la aparición de un potencial de membrana que puede ser interpretado en términos del potencial de Donnan. De esta manera, en soluciones de baja fuerza iónica, la permselectividad impuesta por este potencial se torna evidente y el tipo de ion excluido depende de la identidad de la capa terminal y del pH de la solución, afectando el potencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura. Por otra parte, en soluciones de alta fuerza iónica, el potencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura se aproxima al valor del complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+ en solución. El uso de la microbalanza de cuarzo electroquímica (EQCM) demostró la naturaleza de los iones intercambiados entre la película depositada y solución de electrolito en cada una de las situaciones descriptas anteriormente. Se reconocen tres procesos asociados en el diseño de un biosensor. Por un lado el mediador rédox inmovilizado electrostáticamente sobre el electrodo debe intercambiar electrones con esta superficie. En una segunda etapa, la carga rédox debe propagarse a lo largo de las capas sucesivas. Finalmente, el mediador rédox debe alcanzar el grupo prostético rédox de la enzima para realizar la transferencia electrónica. De esta forma es posible transducir el proceso de reconocimiento molecular del sustrato efectuado por la enzima en una corriente catalítica. En particular, un aumento de la concentración del sustrato resultará en un incremento de la señal amperométrica. En el marco de los procesos que hemos identificado, estudiamos la influencia de la disposición espacial de la GOx adsorbida en una monocapa sobre la comunicación eléctrica entre el mediador y la enzima. En este contexto, mediante medidas de QCM, AFM y técnicas electroquímicas determinamos que el nivel de agregación de proteína sobre la superficie del electrodo incide de manera negativa en la constante de velocidad aparente de la mediación catalítica de la PAH-Os en la oxidación del sustrato de la GOx, β-D-glucosa. Más aún, la cantidad de enzima que interactúa con el mediador es mucho menor a la enzima pesada por QCM. Sin embargo, al aumentar la relación de concentración superficial entre los sitios de Os adsorbidos y la enzima depositada, se incrementaba tanto la cantidad de enzima “cableada” por la PAH-Os como así también la constante de velocidad aparente con el grupo FADH2 de la GOx. El mecanismo de transporte de carga rédox en el sistema PAH-Os / GOx fue estudiado intercalando una capa de GOx activa con capas de apoenzima inactiva, apo-GOx. Ubicando la capa reactiva a distancia variable del electrodo fue posible determinar el coeficiente de difusión de la carga rédox, De, en la estructura electrostática autoensamblada. El valor de De obtenido - en el orden de 10ˉ9 cm² sˉ¹ — implica que el transporte de carga ocurre a través de un mecanismo de saltos electrónicos ya que la difusión fisica de las cadenas poliméricas de la PAH-Os se halla impedida. De esta manera, la construcción capa por capa de estos electrodos permitió definir espacialmente el sistema y estudiar el transporte de carga rédox a lo largo de distancias nanométricas. La posibilidad de propagar la estructura en forma repetida y construir un sistema de multicapas de PAH-Os / GOx permitió establecer similitudes y diferencias entre las distintas capas depositadas. En particular, se encontró que la primer bicapa de PAH-Os / GOx difiere notablemente del resto que le siguen debido a que la PAH-Os interactúa con la enzima únicamente por “debajo”. Por otra parte, al aumentar el pH desde donde se adsorbía la solución de PAH-Os las cantidades de enzima y carga rédox depositadas eran mayores. Esto es debido a que el polielectrolito rédox tiende a adoptar una conformación que expone una mayor proporción de segmentos poliméricos sobre la superficie que inducen la agregación de enzimas. Si bien la proporción de enzimas que reaccionan con la PAH-Os es mayor en este caso, la constante de velocidad permanece relativamente invariable. Exploramos también el uso de un mediador rédox globular de origen dendrítico, PAMAM-Os autoensamblado con la enzima GOx. Los estudios elipsométricos indicaron un ligero comportamiento elástico del dendrímero modificado al adsorberse en forma electrostática sobre una superficie. Más aún, si bien se encontró que la PAMAM-Os participa activamente en el proceso de catálisis de oxidación de la glucosa se encontraron dificultades para definir la concentración volumétrica de sitios de Os en el film. Finalmente, el autoensamblado electrostático permitió analizar la comunicación eléctrica entre la PAH-Os y SBP que posee un centro prostético constituido por un grupo hemo y reduce H2O2 a expensas de los sitios de PAH-Os reducidos. Por otra parte, dado que la GOx en presencia de O2 oxida la glucosa produciendo H2O2, se ensayó un esquema bienzimático donde se depositaron capas de SBP intercaladas con PAH-Os y una capa de GOx en el tope de la estructura. Trabajando a potenciales reductores se registró la respuesta amperométrica debida a la formación de peróxido de hidrógeno por la capa de GOx. En este sentido se logró definir con precisión de nanometros las distintas capas reactivas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que el estudio de electrodos enzimáticos amperométricos autoensamblados electrostáticamente constituye una poderosa herramienta para analizar distintos aspectos relacionados a la transferencia electrónica entre enzimas y el mediador rédox, los mecanismos de propagación de electrones en sistemas químicos integrados y la distribución espacial de arreglos multienzimáticos.A biosensor is a molecular recognition device where a biological macromolecule interacts with an analyte in a unique way that triggers a series of events that are finally transduced in an electrical signal. Among this category we can distinguish the enzymatic amperometric electrodes, where an electrical current is measured over a working electrode due to changes in the redox state of a mediator that panicipates in the biocatalytical process. The regeneration of the initial redox state of the mediator over the surface of the electrode — applying appropiate potentials - results in a catalytic steady state and so is the electrical current. This electron flux can be correlated to the analyte consumption. The study of enzymatic amperometric electrodes has always relied in the immobilization of the redox enzymes in a polymer matrix. Unfortunately, this integrated systems present difficulties in their study at a molecular scale because of their complexity and lack of spatial organization of the biosensor. This prevents a microscopic study of the variables that affect the biosensor response, such as thickness, enzyme concentration and redox mediator concentration or the kinetics between enzyme and mediator. In this thesis we propose a strategy for the design of biosensors based on cnzymatic amperometric electrodes. This involves the use of the electrostatic self-assembly in order to adsorb the redox enzyme and mediator in a sequential and alternate process. Using this technique. it is possible to monito different parameters of the sel-assembled system: the amount of enzyme adsorbed, with the quartz crystal microbalance (QCM); the redox sites deposited, can be obtained from electrochemical methods; the film thickness, using ellipsometry and the surface morfology via the atomic force microscopy (AFM). Moreover, the spatial control in the design of the enzymatic amperometric electrode allows to study the performance according to the structure built. In this context, we worked with two anionic redox enzymes: glucose oxidase (GOx) and soybean peroxidase (SBP), while as redox mediators we employed cationic poly(allylamine) modified with an osmium complex. [Os(bpy)2ClpyCHO]¹, (PAH-Os) and polyamidoamine modified with the same complex (PAMAM-Os). In a first stage, we studied the effect of the electrostatic structure on the electrochemical response of the PAH-Os. Given that the film formed is multi-bipolar. ions can be rejected by repulsive electrostatic forces. In this way, the self-assembly of PAH-Os with anionic polyelectrolytes like poly(styrene) sulfonate (PSS) or poly(vinyl) sulfonate (PVS) allowed to model this behavior as a permselective membrane. The positive charges — given by the amino groups — and the negative charges — given by the sulfonate groups — develop a membrane potential that can be interpreted in terms of the Donnan theory. At low ionic strength Donnan permselectivity of anions or cations is apparent and the nature of the ion exclusion from the film is determined by the charge of the topmost layer and solution pH. On the other hand, at high electrolyte concentration Donnan breakdown is observed and the osmium redox potential approaches the value for the redox couple in solution. The electrochemical quartz microbalance has been used to monitor the exchange ofions with the external electrolyte during redox switching. We can recognize three processes associated to the design of a biosensor. First, the electrostatically immobilized redox mediator must exchange electrons with the electrode surface. Second, the redox charge must travel along the successive immobilized layers. Finally, the redox mediator must reach the enzyme redox prosthetic group for electron transfer. This results in the transduction of the molecular recognition of the substrate by the enzyme and in an increase in the amperometric response. Having identified this series of processes, we studied the influence of the spatial distribution of a monolayer of GOx on the electrical communication between the mediator and the enzyme. QCM, AFM and electrochemical studies have shown that the formation of enzyme aggregates on the surface of the electrode lowers the apparent rate constant of the catalytic redox mediation of PAH-Os in the substrate oxidation of GOx, β-D-glucose. Moreover, the amount of enzyme that interacts with the mediator is lower than the enzyme weighed by the QCM. However, increasing the ratio between the surface concentration of Os adsorbed and enzyme deposited increased the amount of enzyme “Wired” by the PAH-Os and the apparent rate constant between the redox mediator and the FADH2 prostethic group. The redox charge transport mechanism in the PAH-Os / GOx system has been studied varying the relative position of the active GOx enzyme layer with inactive apoenzyme layers, apo-GOx. In this order we were able to determine the diffusion coefficient of the redox charge, De, in the electrostatic self assembled structure. The value of De obtained — in the order of lOˉ9 cm² sˉ¹ — implies that the charge transport mechanism proceeds via electron hopping as the physical diffusion of polymeric strands of PAHOS is hindered. Therefore, the layer-by-layer construction of this electrodes allowed to spatially define the system and to analyze the redox charge transport along nanometric distances. The possibility to expand the structure in a repetitive way and to build a system comprised of multilayers of PAH-Os / GOx allowed to establish similarities and differences between the different deposited layers. We found that the first bilayer of PAH-Os / GOx differs from the following layers on top because the PAH-Os only interacts with the enzyme from “below”. In addition, the pH rise of the PAH-Os solution resulted in larger amounts of enzyme and redox mediator deposited. Lowering the charge density of the redox polyelectrolyte induced a surface conformation where more polymer segments are exposed to the solution interface which in turn favored the enzyme aggregation. Despite that, in this case, the fraction of enzymes that react with PAH-Os is bigger the rate constant remains practically invariant. We also explored the use of a dendritic globular redox mediator. PAMAM-Os, self-assembled with GOx. Ellipsometric studies showed an elastic behaviour of the modified dendrimer when was electrostatically adsorbed on a surface. Moreover, we found that PAMAM-Os readily participates in the catalytic oxidation of glucose but the geometric distribution of the redox couple in the film makes difficult the calculation of the volumetric concentration of redox sites. Finally, the electrostatic self-assembly offered the possibility to analyze the electrical communication between PAH-Os and SBP which has an heme prosthetic group. This enzyme and the PAH-Os in the reduced state converts H2O2 to water. On the other hand, it is known that GOx oxidizes glucose to H2O2 in the presence of O2; in this order a bienzymatic scheme was evaluated where layers of SBP were adsorbed with PAH-Os and a layer of GOx on top of the structure. Working at negative potentials the production of H2O2 from the GOx layer was detected recording the amperometric response. In this sense, the precise nanometric control achieved the separation of the reactive layers. In conclusion, the results obtained suggest that the study of enzymatic amperometric electrodes electrostatically self-assembled is a powerful tool for analyzing different aspects related to electron transfer between enzymes and redox mediators, redox charge transports mechanisms in integrated chemical systems and the spatial distribution of multienzyme arrays.Fil:Wolosiuk, Ricardo Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina