Plasmodium vivax malaria diagnosis employing repetitive sequences of parasite DNA

La malaria es un problema de salud pública mundial en más de 100 paises habitados por un total de 2.400 millones de personas, representando el 40% de la población mundial. Las cuatro especies más comunes que infectan al hombre son: Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, de las cuales, las dos primeras, representan el 95% de las infecciones. En Argentina se plantea la necesidad de trabajar sobre P. vivax, pues no se han registrado casos autóctonos de paludismo por P. falciparum. El propósito de este estudio fue disponer de herramientas moleculares para la detección de P. vivax, aplicables a muestras humanas y vectores, adaptables a las condiciones de recolección y procesamiento básico disponibles en las bases operativas del Programa Nacional de Paludismo. Para ello se obtuvieron y caracterizaron secuencias repetitivas de ADN de P. vivax. El fragmento clonado (instPv10) resultó en un tamaño de 6.899 pb y presentó varias repeticiones directas en tandem y un elemento repetitivo del tipo disperso. Este fragmento incluyó la secuencia específica de P. vivax, insPv10-ll, de 75 pb, que fue empleada como sonda en el desarrollo de la técnica de Dot blot, y la secuencia insPvE/C, dentro de la cual se diseñó el blanco de reacción de PCR. Desde el punto de vista del diagnóstico individual, las técnicas de PCR-sangre e insPv10-11-Dot blot demostraron ser valiosas para emplearse como métodos en el diagnóstico de pacientes sintomáticos y asintomáticos, incluyendo aquellos que retoman de una zona endémica de infecciones causadas por P. vivax, y para el seguimiento de pacientes. Desde la perspectiva epidemiológica la técnica de PCR-elutorios desarrollada en este trabajo permitió efectuar el diagnóstico específico de la especie P. vivax en pacientes sintomáticos y asintomáticos, lo que facilitaría su uso en acciones de detección por búsqueda pasiva y activa. Por otro lado, el método de PCR aplicado a vectores mostró ser una de las pocas alternativas disponibles de alta sensibilidad y especificidad para la detección de P. vivax en mosquitos experimental y naturalmente infectados, con condiciones prácticas de conservación de muestras. Las técnicas desarrolladas en este trabajo son de utilidad para el manejo de brotes y epidemias ya contribuyen a la detección del aumento de la tasa de infección en mosquitos, al estudio de las migraciones y la vigilancia de la quimiorresistencia. El trabajo realizado se enmarca como un desarrollo local de herramientas diagnósticas aplicables al control del paludismo en Argentina.Malaria is a public health problem in more than one hundred countries, meaning that 40% (2,400 million) of the world’s total population is exposed to malaria risk. The four common species that infect humans are Plasmodium vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale, and the two first ones represent 95% of infections. In Argentina it is necessary to work on P. vivax, because there are not local cases of malaria due to P. falciparum. The purpose of this study was to have disposal of molecular tools for the detection of P. vivax, that could be applied to human and mosquito samples, and adapted to the basic conditions of collection and processing available at the operating settings of the National Malaria Programme. In this way we obtained and characterized repetitive sequences of P. vivax DNA. The cloned fragment (insPv10) resulted in a molecular size of 6,899 bp, with several tandem direct repeats and a repetitive interspersed element. This fragment included the insPv10-ll P. vivax-specific sequence (75 bp), employed as probe for the development of the Dot blot technique, and the insPvE/C sequence, inside which the PCR target was designed. At the individual level, the PCR-blood and insPv10-11-Dot blot demonstrated to be valuable methods for the diagnosis of symptomatic and asymptomatic patients, including those returning from P. vivax endemic areas, and for management of cases. At the epidemiological level, the technique of PCR-blood impregnated filter paper disks developed in this work allowed the specific diagnosis of P. vivax in symptomatic and asymptomatic patients. This fact could facilitate its use in active and passive surveillance. The PCR methodology applied to malaria vectors showed to be one of the few available alternatives of high sensitivity and specificity for the detection of P. vivax in experimentally and naturally infected mosquitoes, with practical conditions for sample storage. The techniques developed in this work are useful for management of outbreaks and epidemics, as they contribute to the detection of increased infection ratios in mosquitoes, to the study of migrations, and to the surveillance of drug resistance. This work can be described as a local development of diagnostic tools that can be applied to malaria control in Argentina.Fil:Carnevale, Silvana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina