Cartographie et caractérisation du domaine d'interaction de la Phosphoprotéine P avec le protéine M2-1 du Virus Respiratoire Syncytial Humain

Structure et morphogenèse viraleLe virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable de maladies respiratoires graves (bronchiolites, pneumonies) chez l’homme, principalement chez les nouveau-nés, personnes âgées ou immunodéprimées. En l’absence de vaccin efficace contre ce virus, le développement rationnel de traitements antiviraux constitue un enjeu de taille. Appartenant à la famille des Paramyxoviridae, le VRS est un virus enveloppé dont le génome est constitué d’un ARN simple brin de polarité négative, codant pour 11 protéines. Le génome est répliqué et transcrit par le complexe ARN polymérase dépendant de l’ARN viral. Ce complexe est composé de la nucléoprotéine N, de la polymérase L, de la phosphoprotéine P et du facteur de transcription M2-1 qui assure la « processivité » de la polymérase au cours de la transcription virale. Le complexe polymérase, ne présentant pas d’équivalent dans la cellule, constitue une cible privilégiée pour le développement d’inhibiteurs spécifiques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’interaction entre les différentes protéines du complexe polymérase est donc indispensable afin d’identifier des cibles potentielles. Mason et al. ont mis en évidence que la région [100-120] de la phosphoprotéine P était nécessaire pour interagir avec la protéine M2-1 du VRS. Or nous avons déterminé par RMN que la région [90-100] de la protéine P interagit également avec M2-1. Grâce à des outils de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons donc cartographié plus finement afin de déterminer la région minimale de P, responsable de l’interaction avec la protéine M2-1. Ainsi, par GST-pulldown et en utilisant des protéines recombinantes tronquées produites chez E. Coli, nous avons déterminé que la région [93-110] de la protéine P est le domaine minimal interagissant avec la protéine M2-1.Ce domaine a été ensuite validé in cellula par transfection de vecteurs d’expression dans des cellules de mammifère. Des mutations ciblées ont été introduites dans cette région de P (Alanine scanning) et l’activité ARN polymérase virale a été dosé grâce à un test fonctionnel appelé minigénome. Ainsi nous avons identifié 3 nouveaux résidus hydrophobes critiques dans l’interaction avec la protéine M2-1. De plus, par immunofluorescence et microscopie, nous avons observés que ces variants de P ne recrutaient plus la protéine M2-1 dans les corps d’inclusion. Enfin des expériences de co-immunoprécipitation ont confirmé l’importance des résidus nouvellement identifiés de la protéine P dans l’interaction avec M2-1. Mais cette approche a surtout mis en évidence une corrélation entre l’état de phosphorylation de M2-1 et l’interaction avec P. De façon surprenante, un résidu de P situé en amont à la région [93-110] s’est avéré critique pour la déphosphorylation de M2-1 par P sans impacter sur l’interaction M2-1–P