Cápsidas vacías del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo como plataforma para la inducción de respuesta humoral neutralizante y protectora frente a epítopos B heterólogos

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-01-2017Virus-like particles (VLPs), comprised of viral structural proteins devoid of genetic material, are tunable nanoparticles that can be chemically or genetically engineered, to be used as platforms for multimeric display of foreign antigens. In this PhD thesis, we report the engineering of chimeric VLPs, derived from rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) for presentation of foreign B-cell antigens to the immune system. The RHDV is the prototype species of Lagovirus genus within the Caliciviridae family. The virus capsid comprises 180 copies of a single capsid subunit (VP60). To evaluate the ability of chimeric RHDV VLPs to elicit protective humoral responses against foreign antigens, we tested two B-cell epitopes: a novel neutralizing B-cell epitope, derived from feline calicivirus capsid protein, and a well characterized B-cell epitope from the extracellular domain of influenza A virus M2 protein (M2e). We generated sets of chimeric RHDV VLPs by insertion of the foreign B-cell epitopes at three different locations within VP60 protein (which involved different levels of surface accessibility) and in different copy numbers per site. The immunogenic potential of the chimeric VLPs was analyzed in the mouse model. The results presented here indicated that chimeric RHDV VLPs elicit potent protective humoral responses against displayed foreign B-cell epitopes, demonstrated by both, in vitro neutralization and in vivo protection against a lethal challenge. In addition, we have performed a PEPSCAN analysis to identify linear immunodominant regions within the P2 subdomain of the RHDV capsid protein, aimed at defining new optimized insertion sites for foreign B-cell epitopes. The results obtained enabled the identification of three strong hot spots, one of which presenting structural features potentially compatible for being used as a novel insertion site for the presentation of foreign B cell epitopes. We have shown (i) that foreign B-cell epitopes can be incorporated at least at three different insertion sites, even simultaneously, without affecting the ability of RHDV VP60 to self- assemble into VLPs, (ii) that RHDV VLPs tolerate the insertion of up to at least three tandem copies of a foreign epitope (62 amino acids) at a surface-exposed insertion site, two tandem copies (42 amino acids) at the N-terminal end of the capsid protein or one copy (22 amino acids) at the C- terminal end, and (iii) that P2 subdomain contains three conserved linear immunodominant sites. Taken together, the results obtained in this PhD thesis further extend the potential of RHDV VLPs as an excellent novel vaccine platform.Las VLPs (virus-like particles) son ensamblados macromoleculares constituidos por proteínas estructurales virales, que carecen de material genético y pueden someterse a modificación química o mediante ingeniería genética, para ser utilizadas como plataformas de presentación multimérica de antígenos foráneos. En esta tesis se describe la generación y caracterización de VLPs quiméricas derivadas del virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV) incorporando epítopos B heterólogos. El virus RHDV es el prototipo del género Lagovirus, perteneciente a la familia Caliciviridae. Posee una cápsida formada por 180 copias de la proteína estructural (VP60). Con el fin de evaluar la capacidad de las VLPs quiméricas de RHDV para inducir respuesta humoral específica y protectora frente a antígenos foráneos, seleccionamos dos epítopos B diferentes: un epítopo neutralizante, derivado de la cápsida del calicivirus felino (FCV), recientemente identificado por nuestro grupo, y un epítopo muy bien caracterizado correspondiente al dominio extracelular de la proteína M2 del virus de la gripe (M2e). Se obtuvieron VLPs quiméricas de RHDV con epítopos heterólogos insertados en tres localizaciones distintas de la proteínaVP60 y en diferente número de copias por sitio de inserción. La inmunogenicidad de las VLPs quiméricas se evaluó en el modelo murino. Los resultados obtenidos indicaron que las VLPs quiméricas de RHDV son capaces de inducir respuesta humoral específica y protectora frente a los epítopos B foráneos, demostrada tanto por la neutralización in vitro, como por la protección in vivo inducida frente a un desafío viral letal. Además, mediante la realización de ensayos de PEPSCAN, en esta tesis se han identificado tres regiones lineales inmunodominantes en el subdominio P2 de la proteína VP60. Una de dichas regiones presenta propiedades estructurales potencialmente adecuadas para constituir un nuevo sitio de inserción de epítopos B heterólogos. Los resultados presentados demuestran: (i) que se pueden insertar epítopos B foráneos en al menos tres localizaciones diferentes, incluso simultáneamente, sin afectar la capacidad de la proteína VP60 de autoensamblarse en VLPs, (ii) que las VLPs de RHDV toleran la inserción de al menos tres copias en tándem de un epítopo foráneo (62 aa) en el bucle expuesto L1, dos copias (42 aa) en el extremo N-terminal o una copia (22 aa) en el extremo C-terminal, (iii) que el subdominio P2 contiene tres sitios lineales inmunodominantes conservados. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis amplían el potencial de las VLPs de RHDV como plataforma para el desarrollo de nuevas vacunas, demostrando su capacidad para inducir respuestas humorales potentes y protectoras frente a epítopos B heterólogos insertos en ellas