Suivi de l'état viable non cultivable de souches de Legionella pneumophila soumises à différents stress (thermique ou chloré) : Evaluation de leur pouvoir pathogène

Legionella pneumophila, the causative agent of legionellosis is transmitted to human through aerosols from environmental sources and invades lung’s macrophages. It also can replicate within various protozoan species in environmental reservoirs. Following exposures to various stresses, L. pneumophila enters a Viable Non Cultivable state (VBNC) which is likely to be a survival strategy. The objective of our work was to study the VBNC forms of several strains of L. pneumophila serogroup 1 obtained after thermal and chemical treatments and to evaluate the infectivity of these VBNC forms against macrophages and alveolar epithelial cells. First we studied the physiological patterns of the three different strains (Philadelphia GFP 008, 044 clinical and environmental RNN). For all strains we observed the presence of VBNC bacteria in the native (non stressed) state. The results show that for each strain, three populations of Legionella can be identified: viable and culturable, VBNC and dead cells. Once submitted to the various stresses, we observed that each strain had its own physiological pattern and the presence (or not) of VBNC bacteria was dependent on the applied treatment and the strain used. The second part was related to the study of the pathogenicity of these VBNC forms against macrophages or epithelial cells. The study focused on heat shock treatment at 70°C for 30 min and chlorine dioxide treatment at 4, 6 and 7 mg/L for 60 min at room temperature. The results show that no Legionella VBNC forms were able to grow within the cells and no growth on BCYE medium was observed after co-culture. Then we investigated the behavior of L. pneumophila resuscitated after culture on ameba within macrophages. The results shows that Legionella VBNC induced by heat shock treatment and resuscitated by Acanthamoeba polyphaga co-culture are able to infect macrophages. In conclusion, these results suggest that: (i) the VBNC forms of L. pneumophila are not infectious for macrophages and alveolar epithelial cells in vitro and; (ii) they can be pathogenic for human cells after revivification by an amoeba (A. polyphaga)Legionella pneumophila, l’agent responsable de la légionellose est transmissible à l’Homme par les aérosols environnementaux et infecte les macrophages pulmonaires. Après l’exposition à différents stress L. pneumophila est capable de d’entrer dans un état Viable Non Cultivable (VBNC) qui semble être une stratégie de survie. L’objectif de nos travaux était d’étudier l’état VBNC de différentes souches de L. pneumophila après des traitements thermique et chimique et d’évaluer le pouvoir infectieux des formes VBNC envers les macrophages et les cellules épithéliales alvéolaires. Nous avons étudié les profils physiologiques de L. pneumophila de trois souches différentes. Les résultats montrent que pour chaque souche 3 populations peuvent être identifiées, les légionelles viables cultivables, les VBNC et les bactéries mortes. Lorsque soumises aux stress, chaque souche possède un profil physiologique propre et la présence ou non de bactéries VBNC était dépendante du traitement appliqué et de la souche utilisée. La deuxième partie fut relative à l’étude des traitements thermiques de 70°C pendant 30 min et des chocs au dioxyde de chlore de 4, 6 et 7 mg/L pendant 60 min à température ambiante sur ces VBNC. Aucune légionelle VBNC n’est capable de se développer au sein des cellules et aucune croissance sur milieu BCYE n’a été observée après co-culture. La suite de notre étude a été d’étudier le comportement, envers les macrophages, de L. pneumophila revivifiées après culture sur amibes. Les résultats montrent que les légionelles VBNC induites par choc thermique et revivifiées par co-culture sur Acanthamoeba polyphaga sont capables d’infecter de nouveau les macrophages. En conclusion, ces résultats suggèrent que: (i) les formes VBNC de L. pneumophila ne sont pas spontanément infectieuses pour les macrophages et les cellules épithéliales alvéolaires in vitro et (ii) elles peuvent devenir pathogènes pour les cellules humaines après revivification préalable sur A. polyphag