Quantification of endocannabinoids, arachidonic acid and prostaglandins in tissues from mice treated with the substrate specific COX-2 inhibitor 4'-O-methylhonokiol

Il sistema endocannabinoide è rimasto sconosciuto fino agli anni ’90 quando il primo componente di questo sistema, il recettore per i cannabinoidi di tipo 1 è stato identificato. Il sistema endocannabinoide è implicato in molti processi fisiologici a carico del sistema immunitario, sistema nervoso centrale e sistema circolatorio. E’ ormai noto che disfunzioni del sistema endocannabinoide siano implicate in varie patologie e questo ha accresciuto l’interesse nell’investigare nuove strategie farmacologiche atte a ripristinare la normale attività di questo sistema. Il sistema endocannabinoide è composto principalmente da due recettori accoppiati alle proteine G, recettore di tipo 1 (CB1) prevalentemente presenti nel sistema nervoso centrale, e di tipo 2 (CB2) la cui più alta densità si riscontra in cellule ed organi del sistema immunitario. Successivamente, tutta una serie di ligandi endogeni per i recettori dei cannabinoidi è stata identificata e tali molecole sono state definite endocannabinoidi. Tra queste, il 2-arachidonoil glicerolo (2-AG) e l’N-arachidonoiletanolammina (andandamide, AEA) sono i rappresentati più abbondanti a livello tissutale e più studiati. Nel tempo, ligandi di natura sintetica per recettori CB1 e CB2 sono stati sintetizzati e studiati a scopo terapeutico. Le molecole attive sui recettori CB1, sono caratterizzate da effetti psicotropici e per questo impiegate solamente per studi in vitro e in vivo come controlli. Recentemente gran parte della ricerca si è concentrata sullo sviluppo di ligandi selettivi per i recettori CB2 che non presentano gli effetti collaterali a livello del sistema nervoso centrali tipici dell’attivazione del recettore CB1. Gli endocannabinoidi vengono rilasciati “on demand” a partire da precursori fosfolipidici. Una volta attivati i recettori, queste molecole vengono ricaptate all’interno della cellula dove vengono successivamente degradati. Il 2-AG agisce da agonista totale sia sui recettori CB1 che CB2 e il principale enzima responsabile della sua degradazione è la monoacil-glicerol lipasi (MAGL). L’ AEA agisce invece da agonista parziale per entrambe i recettori e la sua degradazione avviene principalmente ad opera della idrolasi delle ammidi degli acidi grassi (FAAH). 2AG e AEA posso andare incontro ad un altro processo enzimatico ad opera della ciclo-ossigenasi 2 (COX-2) che catalizza la loro ossigenazione in prodotti prostaglandine-like. La COX-2 è un enzima chiave nella regolazione del processo infiammatorio ed è bersaglio dei comuni farmaci anti-infiammatori non steroidei utilizzati nel trattamento di infiammazione, dolore e febbre. La COX-2 è responsabile della formazione delle prostaglandine, importanti nella mediazione del processo infiammatorio, a partire da acido arachidonico. Recentemente è stato identificato che tale enzima è anche responsabile della ossigenazione dei due principali endocannabinoidi 2-AG e AEA, per formare rispettivamente, prostaglandin-glicerol-esteri (PG-GE) e prostaglandin-etanolammidi (PG-EA o prostamidi). Queste molecole, sono risultate avere degli effetti come mediatori dell’infiammazione agendo su recettori diversi da quelli delle prostaglandine ma non ancora identificati. Di recente la ricerca si sta focalizzando sulla inibizione selettiva dell’ossigenazione degli endocannabinoidi senza inibire l’ossigenazione dell’acido arachidonico. Questo effetto può risultare di interesse terapeutico per problemi a carico di tessuti che esprimono in modo costitutivo la COX-2 e dove le prostaglandine svolgono un importante ruolo fisiologico, come il rene. Molecole con queste proprietà vengono chiamate Substrate-Specific Inhibitors (SSIs) della ossigenazione degli endocannabinoidi mediata da COX-2. Il 4’-O-methylhonokiol (MH) è un composto bi-fenilico estratto dall’olio che si ricava dai semi della Magnolia grandiflora che agisce sia in vitro che in vivo come COX-2 SSI. A questa molecola sono state riconosciute proprietà anti-infiammatorie, anti-ossidanti, ansiolitiche e ha dimostrato effetti di neuroprotezione. Il MH agisce da agonista selettivo per i recettori CB2 e come detto sopra, inibisce in modo selettivo l’ossigenazione degli endocannabinoidi mediata dall’enzima COX-2. Ho svolto il mio lavoro di tesi nel laboratorio di ricerca all’Istituto di Biochimica e Medicina Molecolare (IBMM) dell’università di Berna, Svizzera e lo scopo della mia tesi è stato quello di quantificare i livelli di endocannabinoidi e prostaglandine a livello renale per approfondire gli effetti del MH sulla COX-2 in questo organo. Per studiare gli effetti di questa molecola in vivo, topi SWISS albino sono stati trattati con differenti dosi di MH o controllo somministrate per via intraperitoneale. L’esperimento ha coinvolto 4 gruppi di animali, ciascuno costituito da 6 individui che sono stati iniettati con 3mg/Kg, 10mg/kg, 20mg/kg di MH oppure DMSO come controllo. Dopo 2 ore gli animali sono stati sacrificati. La quantificazione degli endocannabinoidi e delle prostaglandine nel rene, cervello, fegato, polmone e milza, è stata fatta applicando un metodo LC-MS/MS correntemente utilizzato nel gruppo del Prof. J. Gertsch dove ho svolto il lavoro di tesi. Questa tecnica prevede l’accoppiamento di un sistema HPLC ad uno spettrometro di massa che permette di quantificare ed identificare i diversi metaboliti a seguito di un processo di ionizzazione. Il metodo utilizzato è stato validato determinando precisione, accuratezza ed effetto della matrice. Dai controlli di qualità effettuati il metodo è risultato preciso, accurato e tutti i valori sono rientrati nei limiti. I risultati hanno mostrato che nel rene i livelli di acido arachidonico e prostaglandine non subiscono nessun cambiamento significativo rispetto al controllo, mentre i livelli di 2-AG e AEA aumentano significativamente. Questo effetto è probabilmente dovuto ad una inibizione selettiva da parte del MH sulla ossigenazione degli endocannabinoidi ad opera della COX-2. Durante questo lavoro ho eseguito la quantificazione di questi metaboliti anche in altri organi e misurato la concentrazione tissutale del MH. Questi dati hanno confermato, ad esempio, la penetrazione del MH a livello cerebrale anche in condizioni di non infiammazione, raggiungendo concentrazioni in linea con le sue attività biologiche. Sempre a livello cerebrale, il trattamento con MH induce una diminuzione dose-dipendente dei livelli di AEA, un effetto che è in linea con uno studio precedente riportato in letteratura. A livello epatico, l’effetto indotto dal MH è simile al rene, infatti si nota un incremento dose-dipendente dei livelli di AEA e 2-AG mentre i livelli di prostaglandine sono per tutte le condizioni, incluso i controlli, al limite o sotto il limite di rilevamento. A differenza del rene, il MH induce un significativo incremento dei livelli di acido arachidonico a livello epatico. Le concentrazioni più alte di MH sono state trovate nella milza (circa 5-10 volte superiori agli altri organi). In questo organo si riscontra un’alta densità di cellule del sistema immunitario e, quindi, di recettori di tipo CB2 ai quali si lega il MH e che potrebbe spiegare tale effetto. Il 2-AG mostra una tendenza a crescere che però non è statisticamente significativa rispetto al controllo. L’acido arachidonico non cambia, mentre i livelli di prostaglandine, che sono relativamente bassi (ma misurabili) nei controlli, aumentano significativamente in seguito al trattamento con MH