Screening di potenziali agenti cardioprotettivi su preparazioni di mitocondri cardiaci

RIASSUNTO ANALITICO Nonostante gli enormi passi avanti fatti dalla medicina nella cura e nella prevenzione delle malattie cardiache, ad oggi queste patologie rappresentano ancora la principale causa di morte nei paesi industrializzati. Tra le principali malattie cardiache vi sono le cardiopatie ischemiche, dovute ad una parziale o totale occlusione delle arterie coronarie, che porta ad una ostruzione dei vasi così da limitare l’afflusso sanguigno nei vari tessuti o organi. Questo ridotto apporto di sangue causa una diminuzione dell’ossigenazione e dell’apporto nutritivo di tali aree, per cui questo flusso non è più sufficiente per la sopravvivenza della cellula, che quindi va incontro a morte. Paradossalmente, il danno da ischemia è aumentato anche nella fase di riperfusione, ovvero la fase successiva all’ischemia in cui vengono ripristinate le condizioni di normalità per la vita cellulare (normale apporto di nutrienti e ossigeno): in questo caso si parla di danno da Ischemia/Riperfusione. La presenza di particolari canali al potassio sulla membrana interna dei mitocondri, conferisce a quest’organello un ruolo importante nella cardioprotezione. Infatti, in seguito all’ischemia e alla successiva riperfusione, la cellula va incontro ad apoptosi che avviene come conseguenza alla generazione di ROS, all’attivazione dello scambiatore Na+/H+, a una risposta infiammatoria e all’apertura di uno poro localizzato a livello della membrana del mitocondrio, mitochondrial permeability transition pore (MPTP), promossa dall’ingresso massivo di ioni calcio all’interno del mitocondrio. L’apertura di questo poro è prevenuta dall’attivazione dei canali al potassio mitocondriale, in particolare mitoBK_Ca e mitoK_ATP. L’attivazione di questi canali, attraverso la depolarizzazione della membrana mitocondriale, determina un ridotto sovraccarico di ioni calcio nella matrice del mitocondrio. Questo abbassamento di concentrazione, a sua volta previene al momento della riperfusione la sostenuta apertura dei MPTP inducendo una cardioprotezione. Sulla base di queste informazioni, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato valutare se i composti in esame fossero in grado di indurre cardioprotezione. I composti testati appartengono a due gruppi selezionati, uno di origine naturale, flavonoidi tra cui quelli presenti nel genere Citrus, e l’altro costituito da composti progettati nell’ottica di ottenere una drug delivery mitocondriale, di sintesi ottenuti coniugando l’attivatore dei canali mitoK_ATP, F81 e Isosteviolo, con il catione liposolubile TPP+. Tale approccio è stato realizzato usando come modelli predittivi la misurazione delle variazioni di potenziale di membrana (ΔΨm) e dell’uptake di Ca^(++) in preparazioni mitocondriali ottenute da cuori di ratto. Il primo screening si è servito di un approccio potenziometrico ed è stato effettuato mediante la misurazione del ΔΨ utilizzando concentrazioni cumulative e crescenti delle sostanze analizzate. I composti che hanno riportato un maggiore interesse sono stati ulteriormente sottoposti a un altro test sperimentale in cui venivano misurati i movimenti dello ione calcio come uptake all’interno del mitocondrio. Le molecole in analisi che hanno determinato un significativo calo nell’uptake di calcio da parte del mitocondrio, hanno fatto ipotizzare un loro coinvolgimento nella cardioprotezione. Per cercare di capire se la loro azione cardioprotettiva fosse dovuta all’interazione con il canale al potassio mitocondriale, sono stati effettuati studi successivi con approccio spettrofluorimetrico con l’uso di una sonda sensibile al Tl^+, catione potassio mimetica. Ulteriori studi ci consentiranno di comprendere l’esatto meccanismo alla base della loro azione cardioprotettiva