Interazione tra anticorpi anti-peptidi citrullinati e sinoviociti nell'artrite reumatoide

L'artrite reumatoide, una delle più comuni malattie autoimmuni, è una malattia complessa ed eterogenea sia dal punto di vista eziopatogenetico che clinico, in cui fattori genetici e fattori ambientali concorrono ad una disregolazione della risposta immune sia innata che adattativa fino a determinare il danno articolare e le eventuali manifestazioni sistemiche. Le sue caratteristiche fondamentali sono la sinovite persistente, l'infiammazione sistemica e la presenza di autoanticorpi, in particolare il fattore reumatoide e gli anticorpi anti-peptidi citrullinati (ACPA). È progressivamente emerso come una delle popolazioni cellulari della sinovia, i sinoviociti di tipo fibroblastico (FLS), non sia meramente modificata dall'ambiente infiammatorio locale, ma partecipi attivamente alla distruzione della cartilagine, rivestendo un ruolo fondamentale nella patogenesi del danno articolare. In questo contesto, sembrano avere una funzione importante gli ACPA, che oltre ad essere marcatori diagnostici estremamente sensibili e specifici correlano con la prognosi della malattia ed hanno in ultima analisi permesso di individuare due sottotipi di AR, distinti per caratteristiche cliniche, genetiche e molecolari. Allo scopo di analizzare il ruolo degli ACPA nella produzione di citochine e chemochine da parte dei FLS, sono stati selezionati alcuni pazienti con AR nel cui siero fossero presenti ACPA a titolo elevato. Gli ACPA sono stati isolati dal siero mediante cromatografia di affinità su peptidi citrullinati immobilizzati su fase solida. La specificità degli anticorpi purificati è stata poi confermata mediante test ELISA. Da frammenti di tessuto sinoviale prelevato mediante sinoviectomie sono state approntate colture di FLS. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati al terzo-quinto passaggio delle cellule in coltura. Gli ACPA sono stati incubati a tempi e concentrazioni differenti su sinoviociti prelevati da pazienti con AR oppure con osteoartrosi. Si è poi proceduto a valutare il pattern di citochine prodotte nel supernatante di coltura. In esperimenti preliminari è stato utilizzato un multiarray specifico per citochine umane ed è stato osservato un notevole aumento di produzione di CCL5/RANTES a seguito dell’incubazione dei FLS con APCA. Ulteriori conferme di questo risultato iniziale sono state ottenute mediante ELISA, basato su anticorpi monoclonali e policlonali specifici per CCL5/RANTES. Oltre al dosaggio della proteina nel supernatante, è stato dosato mediante RT-PCR anche l’mRNA codificante CCL5/RANTES ed è stato dimostrato un aumento dopo stimolo con ACPA. Al fine di analizzare le vie di signalling intracellulare coinvolte nella produzione di CCL5/RANTES, è stato effettuato uno screening mediante un sistema di tipo multiarray: nel caso dei sinoviociti stimolati con ACPA si ha una attivazione delle vie di fosforilazione di ERK1/2, p38, c-Jun, HSP27 e CREB maggiore rispetto a quanto rilevabile con le IgG di controllo. Per ottenere una quantificazione più precisa della misura in cui queste vie venissero attivate, sono state misurate mediante western blotting quantità relative delle forme fosforilate e non fosforilate di alcune delle proteine coinvolte, come ERK1/2, p38 e JNK. I dati ottenuti indicano che gli ACPA inducono produzione di CCL5/RANTES da parte dei FLS; tale produzione è particolarmente elevata quando i FLS derivano da pazienti con AR ed è regolata dall'attivazione dei componenti della cascata delle MAP chinasi, in particolare di ERK