Produzione di citochine proinfiammatorie da parte delle cellule dell'immunita' innata umane in risposta a M. tuberculosis o a M. bovis BCG, con particolare riguardo all'interluechina-1 beta

Tra le malattie ad eziologia batterica, la tubercolosi è ancora oggi quella che causa il maggior numero di morti a livello globale. Si stima che l’agente causale della malattia, Mycobacterium tuberculosis (Mtb), infetti circa 1/3 della popolazione mondiale in maniera latente e causi la morte di 1.5 milioni di individui per anno. La via prevalente di trasmissione del batterio è quella aerogena. Una volta che Mtb ha raggiunto l’alveolo polmonare si stabilisce un delicato equilibrio tra l’agente infettivo ed il sistema immunitario dell’ospite, da cui dipenderà l’esito più o meno benigno dell’infezione. In particolare, si ritiene che le cellule dell’immunità innata (macrofagi, cellule dendritiche, monociti, cellule natural killer-NK), residenti nel polmone o richiamate in tale sito dal processo infiammatorio, siano degli elementi chiave nel determinare l’evoluzione futura del rapporto ospite-parassita. Tali cellule svolgono, infatti, numerose funzioni effettrici rivolte al controllo dell’infezione che, in generale, includono la messa in atto di potenti meccanismi batterici o la produzione di citochine pro-infiammatorie. Dall’altro lato, Mtb ed altri micobatteri, hanno evoluto sofisticati meccanismi di evasione che permettono a tali germi di resistere al killing intracellulare o di interferire con il pattern di citochine prodotte dall’ospite, stabilendo un ambiente favorevole alla propria sopravvivenza e replicazione. Il presente lavoro di tesi rappresenta l’approfondimento di studi già da tempo in corso nel laboratorio ospitante, volti da un lato all’identificazione di fattori di virulenza chiave di Mtb espressi nel rapporto con l’ospite, dall’altro all’identificazione di nuove funzioni protettive delle cellule dell’immunità innata che potrebbero giocare un ruolo importante nelle prime fasi dell’infezione. In particolare, scopo della presente tesi è stato quello di studiare le capacità stimolatorie/immunomodulanti di Mtb, e/o del ceppo vaccinale attenuato M. bovis BCG, su macrofagi e cellule NK umane con particolare riguardo alla produzione di IL-1 beta. Tale citochina rappresenta, infatti, una molecola chiave nell’avvio e nel mantenimento della risposta infiammatoria, contribuendo alla difesa dell’ospite mediante l’aumento delle proprietà battericide dei macrofagi e l’avvio della risposta adattativa mediata dalle cellule Th1. In una prima fase del lavoro si è proceduto ad infettare macrofagi umani, derivati da monociti di sangue periferico di donatori sani, con un ceppo virulento di laboratorio di Mtb (Mtb H37Rv) e con un ceppo mutante da esso derivato, precedentemente costruito nel laboratorio ospitante (1). Tale ceppo mutante, chiamato Mtbrv1794ko, risulta difettivo per il gene rv1794 (espG5), il cui ortologo in Mycobacterium marinum è stato dimostrato essere coinvolto nella modulazione della risposta infiammatoria di macrofagi umani. Dopo 24 h di infezione sono stati raccolti i sopranatanti di coltura e si è proceduto a misurare il contenuto di citochine proinfiammatorie in tali sopranatanti con tecniche di citometria a flusso (cytokine bead assay). Mentre i livelli di TNF-alfa, IL-10, IL-6 e IL-23 erano del tutto comparabili tra il ceppo wild-type Mtb H37Rv ed il ceppo mutante, i macrofagi infettati con Mtbrv1794ko rilasciavano l’IL-1beta nei sopranatanti a livelli significativamente più elevati rispetto a Mtb H37Rv. Tali risultati sono stati confermati anche da esperimenti di Western blot i quali hanno rilevato una maggior quantità di IL-1beta nei sopranatanti dei macrofagi infettati con il ceppo mutante rispetto a quelli infettati con il ceppo wild-type, nonostante i livelli di IL-1beta nel citoplasma delle cellule infette fossero paragonabili per i due ceppi. Tale risultato suggerisce che il prodotto del gene espG5 possa interferire direttamente od indirettamente con la secrezione di IL-1 beta da parte delle cellule infettate, e quindi, favorire la sopravvivenza del germe tramite una down-regolazione della risposta infiammatoria. In esperimenti successivi, Mtb e M. bovis BCG sono stati utilizzati per stimolare in vitro un altro tipo cellulare possibilmente coinvolto nell’immunità innata antitubercolare, rappresentato dalle cellule NK. Tali esperimenti hanno dimostrato che entrambe le specie batteriche inducevano la produzione da parte di tali cellule di IFN-gamma, un’altra citochina chiave responsabile dell’attivazione dei macrofagi, TNF-alfa ed anche di IL-1beta. La produzione di IL-1beta correlava in maniera statisticamente significativa con il grado di attivazione cellulare, valutato come espressione del marker CD69 e si verificava anche quando la stimolazione cellulare veniva effettuata con biglie di polistirene ricoperte con il micolil-arabinogalattano-peptidoglicano, lo scheletro fondamentale della parete dei micobatteri. Tali dati confermano studi molto recenti della letteratura indicanti, per la prima volta, la capacità delle cellule NK di produrre IL-1beta e suggeriscono che la produzione di tale citochina nelle prime fasi dell’interazione di Mtb con l’ospite potrebbe rappresentare un’ulteriore importante funzione effettrice di queste cellule. E’ interessante notare che, analogamente a quanto osservato con i macrofagi, la stimolazione di cellule NK con Mtbrv1794ko ha indotto più elevati livelli di IL-1beta rispetto al ceppo parentale, indicando che il prodotto del gene espG5 possa essere coinvolto nella modulazione della produzione di IL-1beta in vari tipi di cellule immuni innate dell’uomo