Asincronismo replicativo e modificazioni epigenetiche inducibili per i loci DLEU1 e TP53 del Genoma umano

Il mantenimento dell’informazione nel progredire della replicazione possiede meccanismi di controllo e di regolazione molto fini per garantire l’originalità e l’assenza di errori. La replicazione del DNA cromosomico è frazionata in vari repliconi non tutti attivati contemporaneamente, ma ciascuno in un preciso momento della fase S; quindi la durata della fase S viene determinata dal numero di repliconi e dal loro rateo di attivazione. Le regioni cromosomiche sono differenziate, per la replicazione e quindi anche per la trascrizione, mediante un’organizzazione temporale che prevede che geni attivi vengano replicati nella fase “S” iniziale, geni meno attivi nella fase S tardiva. Lo studio del tempo di replicazione viene usato come marcatore delle fasi iniziali o tardive della replicazione mostrando che nelle cellule umane con aberrazioni cromosomiche esiste un’alterata sequenza replicativa con evidenti ritardi nel tempo di replicazione. Recentemente è stato dimostrato che le mutazioni sono influenzate da fattori genetici ed epigenetici come il tasso di ricombinazione, la presenza di isole CpG, lo status di trascrizione, la presenza di sequenze ripetute, dallo stato della struttura della cromatina, che è risoltata in strettissima correlazione con l’attività di trascrizione genica. Le mutazioni sono correlate al tempo di replicazione: le regioni che si replicano durante la fase S iniziale possiedono alta attività trascrizionale, quelle replicate nella fase S tardiva sono trascrizionalmente inattive e mostrano maggior incidenza di mutazioni spontanee. Molti studi hanno altresì evidenziato che l’associazione fra tempo di replicazione e stato trascrizionale è mantenuta per i loci ad espressione monoallelica (tra cui i geni del cromosoma X nelle femmine nei mammiferi), questi si replicano in maniera asincrona, mentre gli alleli omologhi ad espressione biallelica si replicano in maniera sincrona; ancora geni soggetti ad imprinting mostrano tempi di replicazione dipendenti dallo stato di acetilazione/metilazione degli istoni (e metilazione DNA); questo mostra la strettissima correlazione della replicazione con lo stato della cromatina. Anche in loci ad espressione biallelica è stato osservato asincronismo replicativo, e questo può essere interpretato come conseguenza di alterazioni non fisiologiche dell’espressione genica. Ne sono esempio i geni TP53 ed RB1 in patologie tumorali quali il mieloma, il linfoma di Hodgkin ed altre. Un’interpretazione di questi casi, coerentemente con il legame trascrizione-replicazione, suggerisce che la replicazione allele specifica rifletta l’attivazione trascrizionale di un allele o il silenziamento dell’altro, con conseguente perdita di attivazione funzionale che, nei geni onco-soppressori può essere associata allo sviluppo del cancro. Le evidenze citate la stretta correlazione fra lo stato della cromatina, espressione genica e replicazione ci ha portato a studiare in che misura composti chimici, con azione mutagena nota possano indurre alterazioni epigenetiche, e se queste siano legate alla produzione di aberrazioni; l’asincronismo replicativo ed iol tempo di replicazione del DNA sono stati indicati come marcatori di modificazioni epigenetiche. Fra i vari metodi per studiare il tempo di replicazione, abbiamo scelto di usare la tecnica FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) con sonde locus specifiche. Quando si analizzano cellule in proliferazione, ad ogni locus può essere presente un allele non replicato (singolo segnale) oppure già replicato (doppio segnale); è possibile quindi valutare, in un ampio campione di cellule, lo stato di replicazione complessivo basandoci sui segnali evidenziati dalle sonde utilizzate nella tecnica FISH, ed evidenziare così la presenza o meno di asincronismo replicativo e la sua entità. Tramite la tecnica FISH sui loci DLEU1 (Deleted in Lymphocytic LEukemia, oncosoppressore, 13q14.3) e tp53 (onco-soppressore, 17p13.1). L’analisi è stata eseguita su nuclei interfasici, sono state inoltre analizzate metafasi per la valutazione dell’induzione di delezioni. Obiettivo quindi dello studio è quello di verificare l’azione degli agenti, APC (Afidicolina, inibitore della replicazione del DNA) ed Azacitidina (un analogo di base con attività demetilante), di indurre alterazioni epigenetiche rilevabili come l’alterazione dello stato replicativo. A tale scopo è previsto l’utilizzo di questi agenti in concentrazioni crescenti in due distinte colture cellulari, con un intervallo di concentrazioni noto per la sua efficacia, al fine di verificare una possibile relazione dose-effetto