Studio preliminare per lo sviluppo di scaffold a base di gelatina e nanotubi di carbonio: applicazioni in Ingegneria dei Tessuti Cardiaci

Introduzione: Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di decesso nei paesi industrializzati. Ad oggi, nei pazienti con compromessa funzionalità cardiaca, le terapie possono risultare inefficaci nell'offrire benefici. Per ovviare a tale problematica è necessario ricorrere a trattamenti invasivi, dai supporti circolatori meccanici al trapianto d’organo. L’ingegneria tissutale cardiaca si propone di studiare nuove strategie di trattamento delle patologie allo scopo di rigenerare porzioni di tessuto che hanno perso la propria capacità contrattile. Per essere clinicamente rilevante, un tessuto cardiaco ingegnerizzato deve possedere proprietà funzionali e morfologiche il più simile possibili al miocardio del ricevente: a tale scopo gli scaffold, costituti di biomateriali di origine naturale o sintetica, si sono dimostrati strumenti molto utili per sostituire tessuti malati, malformati o mancanti. Scopo: messa a punto di scaffold a base di gelatina e nanotubi di carbonio (CNT) per applicazioni in ingegneria tissutale cardiaca. Materiali e metodi: sono stati preparati scaffold a base di gelatina e CNT 0,3% e 0,9%, crosslinkati con genipina (0,2%), percentuali scelte in seguito a studi di conduzione elettrica e citotossicità, e seminati con una linea cellulare di cardiomioblasti di ratto H9c2 (n=12, rispettivamente). Le cellule sono state tenuta in coltura per 10 giorni su tali supporti ed è stato valutato il tasso di crescita attraverso test di vitalità. Il profilo fenotipico e le eventuali variazioni morfologiche della linea cellulare H9c2, dovute ai supporti utilizzati, sono stati caratterizzati tramite tecniche di immunofluorescenza per l’analisi di marcatori di differenziamento muscolare (miogenina D) e cardiaco (catena leggera della miosina). Al fine di valutare il fenotipo cardiaco, il profilo trascrittomico del sistema dei peptidi natriuretici (PN) (ANP, BNP, CNP e recettori NPR-A, NPR-B e NPR-C) e dell’endotelina (ET) (prepro-ET1, ET-A, ET-B) sono stati analizzati tramite tecniche di Real-Time PCR. Risultati: l’analisi immunoistochimica ha mostrato che la riduzione dal 10% al 1% di FBS (C10% e C1%). ha determinato cambiamenti verso un fenotipo di tipo miogenico, mentre l’aggiunta di acido retinoico 50 nM e la concomitante riduzione di FBS ha indotto un fenotipo cardiaco, come anche confermato da studi di Real-Time PCR condotti per valutare l’espressione di PN e ET. La vitalità cellulare di C1% e CAR rispetto a C10% è risultata diminuita nei primi 3 giorni di coltura, così come quella di CNT0,3% e CNT0,9%, per poi arrivare a livelli paragonabili al giorno 10 con i relativi controlli. Con studi di Real-Time PCR, in CNT0,3% e CNT0,9%, si è osservata una diminuzione dei livelli di espressione dell’intero sistema dei PN rispetto ai C10%. Analogamente i livelli di espressione di prepro-ET1, ET-A ed ET-B risultavano significativamente diminuiti in CNT0,3% e CNT0,9% rispetto al C10%. Al fine di evidenziare il differenziamento dei miociti cardiaci in coltura sui nanotubi è stata valutata l’espressione di Connessina (CX)-43: anch’essa è risultata significativamente diminuita sia nei CNT0,3% e CNT0,9% rispetto ai C10% (p=0,002; p=0,007 rispettivamente). Conclusioni: in questo lavoro di Tesi, come atteso, è stato osservato che le cellule H9c2 hanno la capacità di differenziare verso un fenotipo scheletrico o cardiaco in risposta alle condizioni di coltura utilizzate. Questo dato è stato confermato anche dall’espressione di marker cardiaci specifici, quali il sistema dei PN e dell’ET, che sono risultati contro-regolati nelle H9c2 differenziate in cardiomiociti in risposta alla supplementazione del mezzo con acido retinoico. Le curve di crescita ottenute hanno mostrato, nei primi giorni, in C1% e CAR rispetto a C10% una diminuzione della vitalità cellulare, risultato osservato anche in CNT0,3% e CNT0,9% e probabilmente dovuto al tempo necessario alla cellula di adattarsi al materiale. In CNT0,3% e CNT0,9% non è stata osservata una variazione significativa dei biomarcatori cardiaci rispetto ai controlli. Una possibile spiegazione potrebbe essere correlata ai ridotti tempi di coltura, incapaci di stimolare il cambiamento del pattern di espressione genica caratteristico di un fenotipo cardiaco più maturo, sottolineato anche dalla diminuita espressione della CX-43, coinvolta nella formazione delle gap-junction. Dall’analisi immunoistochimica di CNT0,3% e CNT0,9% il forte background fluorescente del materiale, dovuto alla presenza del crosslinkante genipina, non ha dato indicazioni sul tipo di differenziamento. Questo studio rappresenta il primo passo nello sviluppo di scaffold conduttivi per applicazioni nell’Ingegneria dei Tessuti Cardiaci. Ulteriori analisi sulle qualità del biomateriale, unite a più elaborate strategie di coltura cellulare e all’apporto della stimolazione elettrica permetteranno di ottenere più approfondite informazioni sulle modifiche fenotipiche indotte nelle cellule