Industrializzazione di un bioreattore a gradiente tridimensionale

In applicazioni di biologia e medicina, il controllo dell'interazioni tra le diverse unità, dalle proteine alle cellule, facilita la comprensione globale e talvolta la manipolazione dei sistemi viventi e relativi fenomeni biologici; in questo panorama si è collocata negli anni, la scienza delle nanotecnologie con scaffolds e biomateriali nanostrutturati impiegati come rivestimenti per impianti e protesi, che hanno apportato miglioramenti nel campo della progettazione e ricostruzione di tessuti e della medicina riparativa. Le aree di impiego della micro e nanotecnologia sono diverse e tra queste consideriamo il campo dell'ingegneria dei tessuti, medicina diagnostica e terapeutica. Il sistema “corpo umano” rappresenta una complessa rete di molecole, organelli, cellule, tessuti e organi interconnessi tra loro mediante un elevato numero di interazioni e trasformazioni. Oltre alle componenti biochimiche appena elencate, giocano un ruolo fondamentale nella comprensione del comportamento cellulare, anche gli aspetti biofisici tra cui pressione, flusso, morfologia e gradienti, che agiscono sia a livello individuale che sinergico. La complesstà dei meccanismi della biologia cellulare all'interno del corpo umano ha reso difficile la comprensione del comportamento delle cellule, che può essere analizzato solo se considerato nel contesto delle interazioni tra componenti biofisiche e biochimiche; sono proprio questi aspetti che si manifestano nell' ambiente circostante la cellula ad influenzarne il comportamento, in modo particolare relativamente all'adesione, morfologia e differenziamento. Queste problematiche sono quelle che hanno reso necessario e fondamentale lo studio e l' impiego di dispositivi in grado di garantire un controllo temporale, spaziale e chimico dei suddetti fattori biofisici al fine di poter comprendere la complessità della biologia cellulare. E' proprio in questa ottica che si ricorre all'utilizzo dei bioreattori, dispositivi microfluidici che permettono di ricreare in vitro le caratteristiche presenti in vivo. Tra le peculiarità dei bioreattori fondamentale è la formazione e il mantenimento di un flusso che è ciò che garantisce le connessioni tra le varie componenti del corpo umano e che induce forze meccaniche tali da influenzare citoscheletro, morfologia e adesione cellulare. Il punto di forza di tutti i dispositivi microfluidici è infatti l'accurato controllo sul comportamento dei fluidi che costituiscono i diretti responsabili dell'induzione di risposte biologiche e sono essi stessi una risposta biologica a determinati stimoli. L'obiettivo, ma anche la sfida più grande, nell'ambito dell'impiego dei bioreattori, è la comprensione e la capacità di ricreare in vitro il microambiente che la cellula sente in vivo inteso come l'insieme complesso di condizioni fisiche, chimiche e biologiche che circondano la cellula e ne influenzano le funzioni principali quali proliferazione e differenziamento. L'impiego di nanotecnologie nell'ambito dell'ingegneria dei tessuti ha come obiettivo la rigenerazione e l'assemblaggio di tessuti/organi funzionali usando specifiche combinazioni di cellule, scaffold e meccanismi di supporto temporale quali ad esempio, segnali biochimici, meccanici ed elettrici per la sintesi di nuovi tessuti. Questo settore può essere suddiviso in due grandi aree di rilevanza: quella terapeutica, che ricopre la rigenerazione di tessuti e organi, e l'area diagnostica, in cui i tessuti sintetizzati in vitro vengono impiegati per studi tossicologici, metabolici e di rilascio di farmaci. Con il termine bioreattore si intende un sistema microfluidico al cui interno possono essere ricreate condizioni strettamente controllate al fine di consentire e/o indurre specifici comportamenti su cellule o tessuti coltivati in vitro, fornendo segnali biochimici e fisici regolatori che inducano alla differenziazione cellulare e/o produzione di matrice extracellulare prima dell'impianto in vivo. Diventa indispensabile in questo scenario quindi, mettere in risalto l'importanza della formazione di gradienti all'interno dei bioreattori dato che, negli ultimi anni, la necessità di scoprire come l’essere umano si sviluppa, ha portato studiosi del settore ad investigare sulla correlazione tra la specializzazione dei tessuti del nostro corpo e la concentrazione di talune specie chimiche. Questi sono i concetti che stanno alla base della teoria dell'embriogenesi e morfogenesi: quest'ultima fa riferimento al processo che porta allo sviluppo di una determinata forma e struttura, mentre la prima, identifica il processo in cui un embrione si forma e si sviluppa; questo processo inizia subito dopo la fecondazione dell’ovulo e quindi dalla nascita dello zigote. Il punto di contatto, a livello fisiologico, tra embriogenesi e morfogenesi si ha durante la prima specializzazione dei tessuti che avviene allo stadio embrionale, subito dopo il processo di gastrulazione. La differenziazione delle cellule in questa fase è regolata da geni omeotici , i quali presiedono alla sintesi di particolari proteine che hanno un controllo sull’attività cellulare, indirizzandone la specializzazione. L’attivazione di questi geni è controllata da segnali chimici specifici costituiti da gradienti di sostanze dette agenti morfogeni (o fattori di induzione). I morfogeni sono sostanze chimiche che si propagano da un punto dell’embrione e agiscono sulle cellule in modo dipendente dalla loro concentrazione [3]. Uno fra i più studiati è il Sonic Hedgehog Homolog (SHH), una proteina della famiglia delle hedgehog (presenti nei mammiferi) che rappresenta uno dei ligandi della via di segnalazione dell’hedgehog. Questa via fisiologica permette la regolazione dell’organogenesi nei vertebrati e gioca un ruolo fondamentale nel differenziamento dei tessuti costituenti dita, arti e nell’organizzazione del sistema nervoso. Un primo prototipo di bioreattore a gradiente è stato progettato dall'Ingegnere Giovanni Vozzi, docente di Bioingegneria industriale e ricercatore del Centro "E. Piaggio" dell'Università di Pisa, che insieme ai suoi collaboratori Gianni Orsi e Carmelo De Maria, ha sviluppato un bioreattore denominato 3D Gradient Maker capace di ricreare nello spazio tridimensionale un gradiente di concentrazione modulabile in modo da simulare al meglio l'ambiente embrionale. Il bioreattore sviluppato risulta essere molto compatto e facile da usare, è realizzato in silicone biocompatibile e composto principalmente da quattro parti: una serie di canali di immissione dei fluidi, che permette di creare diverse concentrazioni della specie che si vuole in ingresso, una camera di coltura cellulare o per la creazione dell'idrogel, matrici geliformi tridimensionali con un gradiente di proprietà meccaniche. Questa caratteristica è risultata molto importante dal punto di vista della ricerca in quanto, studi recenti hanno infatti evidenziato che, modulando le proprietà meccaniche del substrato di adesione cellulare, è possibile anche controllare il differenziamento delle cellule staminali. Il bioreattore possiede inoltre un sistema di chiusura trasparente in modo da visionare in tempo reale ciò che accade all'interno della camera di coltura cellulare e dei canali, e una pompa peristaltica o a siringa che immette i fluidi nella camera di coltura con una portata similare a quella del distretto biologico in esame. Questo lavoro di tesi consiste nello studio del progetto del bioreattore 3D Gradient Maker, andando ad analizzarne i punti di debolezza ed ottimizzando la struttura del dispositivo in modo da validare il prototipo e tradurre questo studio accademico in un dispositivo commercializzabile impiegato per la sperimentazione dei farmaci e per la ricerca nei settori dei biomateriali e della medicina rigenerativa. Partendo dallo studio del brevetto del bioreattore 3D Gradient Maker, sviluppato dall'Ingegnere Giovanni Vozzi insieme ai suoi collaboratori Gianni Orsi e Carmelo De Maria, questo lavoro di tesi ha avuto come obiettivo l'analisi dei punti di debolezza del prototipo, e la valutazione di modifiche strutturali da applicare al bioreattore, al fine di andare a migliorare e/o risolvere completamente i punti critici mostrati dal sistema, in modo da validare il prototipo e tradurre questo studio accademico in un dispositivo commercializzabile impiegato per la sperimentazione dei farmaci e per la ricerca nei settori dei biomateriali e della medicina rigenerativa. Il lavoro si è quindi focalizzato sulla riprogettazione del sistema di chiusura del dispositivo in quanto è risultato l'aspetto che riflette i maggiori limiti del prototipo sviluppato precedentemente con conseguente revisione del metodo di realizzazione dello stampo del dispositivo; di quest'ultimo infatti è stata mantenuta l'idea di piani perpendicolari di mixing del sistema microfluidico per garantire la formazione del gradiente di concentrazione tridimensionale mentre, è stata totalmente rivoluzionata la struttura del bioreattore in modo da garantire una chiusura ermetica del sistema. Questo lavoro di tesi si è quindi articolato partendo dalla progettazione di uno stampo per ottenere una sistema di chiusura completamente chiuso in PDMS, a calzino, con cui andare a serrare i canali realizzati mediante laser su una lastra di plexiglass. Sono state effettuate delle simulazioni tramite il software Comsol 4.3b® per l'analisi a elementi finiti, modulo “Structural Mechanics” per la simulazione del comportamento meccanico della struttura 2D a “calzino” del PDMS. Lo scopo di tale studio è stato, verificare che le pressioni che si sviluppano nella struttura fossero tali da bilanciare le pressioni sviluppate all'interno del sistema microfluidico, al fine di garantire la tenuta della chiusura in PDMS sui canali in plexiglass. Successivamente è stata affrontata la parte di progettazione, mediante software CAD Autodesk Inventor 2012® degli stampi, per l'ottenimento della chiusura in silicone, e realizzazione fisica degli stampi, prima in PLA poi in ABS ed infine in alluminio. Il sistema è stato testato con prove di portata al fine di confermare i risultati forniti dalle simulazioni; l'obiettivo fissato è stato di ottenere una chiusura dei canali tali da garantire la completa tenuta del sistema microfluidico. Questo lavoro di tesi mira a conferire al bioreattore 3D Gradient Maker un nuovo aspetto; mantenendo l'idea di piani perpendicolari di mixing per garantire la formazione di un gradiente tridimensionale, l'idea è quella di realizzare il sistema costituito da quattro lastre di silicone distinte, su cui sono ottenuti i canali, adagiate su un supporto in plexiglass in cui queste vengono inserite ad incastro, secondo lo schema sviluppato nel precedente prototipo, il tutto chiuso ermeticamente con delle viti. Tale soluzione è risultata ottimale in relazione alla risoluzione delle problematiche, precedentemente riscontrate, nella realizzazione del primo prototipo; in particolare ci ha permesso di ovviare ai problemi relativi alla difficoltà di reticolazione e degassazione del silicone nello stampo, lavorazione manuale di qualsiasi parte del dispositivo ed infine ottenere una chiusura completa e di facile manualità del sistema. Parallelamente a questa fase di progettazione sono state condotte delle simulazioni fluidodinamiche, mediante software Comsol 4.3b, del bioreattore 3D completo, per andare a simulare la formazione di un gradiente tridimensionale di concentrazione facendo studi di robustezza di tale gradiente in funzione di variazioni delle portate in ingresso, dovute ad eventuali sbilanciamenti nel settaggio delle pompe peristaltiche usate. A conclusione del lavoro di tesi, è stata condotta una ricerca in termini di analisi di mercato al fine di puntare alla commercializzazione del prodotto che permetterà la sperimentazione di farmaci e potrà essere impiegato per la ricerca nei settori dei biomateriali e della medicina rigenerativa, andando a costituire il dispositivo biomedico capace di supportare la ricerca di base nel campo dell'embriogenesi e dello sviluppo dei tessuti. Il brevetto in questione infatti, è stato recentemente acquisito dalla Linari Engineering s.r.l., azienda pisana premiata anche dalla camera di commercio nel 2010 come migliore azienda innovativa della provincia per i suoi prodotti nella medicina riabilitativa (AvDesk) e nella produzione di nanomateriali (RT Collector) e l'indagine di mercato presente in questo lavoro di tesi, mira alla traduzione del prototipo in un prodotto commercializzabile strategico per renderlo capo stipite di una nuova linea di bioreattori all'avanguardia in grado di offrire, primi sul mercato mondiale, una suite completa di competenze e soluzioni per la coltura cellulare avanzata che spazia dalla produzione degli scaffold nano strutturati a i bioreattori dinamici all'interno del quale si esaltano le potenzialità di questi nano substrati. In questo modo sarà possibile rivolgersi a centri di ricerca e aziende farmaceutiche come referenti principali nello sviluppo di nuovi farmaci e trials clinici