Un nuovo derivato del 2,3-difenilpirido[1,2-a]pirimidin-4-one inibisce l'espressione della interleuchina-6 e del fattore chemiotattico MCP-1 nelle cellule endoteliali

RIASSUNTO INTRODUZIONE I polifenoli sono composti che si trovano in molti alimenti come tè, caffè, frutta, verdura, olio di oliva e vino rosso e manifestano diverse proprietà farmacologiche, ricevendo recentemente una grande attenzione come possibile supporto dietetico terapeutico nelle malattie cardiovascolari (cardiovascular disease, CVD). Nonostante siano dotati di attività interessanti sulla disfunzione ed attivazione endoteliale, sull’attivazione piastrinica/aggregazione e come antitumorali, la maggior parte dei flavonoidi studiati possiedono uno svantaggio significativo, in quanto i loro effetti si trovano a concentrazioni alte e non fisiologiche, raramente raggiungibili in circolo. Inoltre, la loro bassa solubilità e stabilità, accoppiati con proprietà farmacocinetiche sfavorevoli, e la capacità di modulare bersagli molecolari supplementari e indipendenti, limitano sensibilmente il loro sfruttamento come integratori alimentari o come potenziali farmaci1. Tuttavia, essi rappresentano una logica ed eccellente fonte di ispirazione per la chimica farmaceutica, in quanto partendo dalla loro struttura chimica si possono progettare analoghi sintetici che siano più sicuri e più efficaci. Il fattore di necrosi tumorale (tumor necrosis factor-α, TNF-α), è una citochina pro-infiammatoria che induce attivazione dell'endotelio vascolare e svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della malattia vascolare, promuovendo infiammazione, stress ossidativo, rimodellamento vascolare e aterogenesi2,3. Molti fattori di rischio cardiovascolare contribuiscono alla patogenesi della disfunzione endoteliale, attraverso la modulazione della via di trasduzione del segnale del TNF-α, in cui è coinvolto il fattore di trascrizione NF-κB che agisce come mediatore centrale per la regolazione di geni implicati nelle risposte immuno-infiammatorie4. Nel siero di pazienti a rischio di CVD, sono stati trovati elevati livelli della proteina chemiotattica (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1) e della citochina infiammatoria interleuchina-6 (IL-6), che vengono ritenuti marcatori dell'attività infiammatoria in questi pazienti5-7. Le cellule endoteliali stimolate in vitro con il TNF-α esprimono entrambi i marcatori che vengono rilasciati nel surnatante cellulare. SCOPO DELLA TESI Mossi da queste considerazioni e dal voler approfondire gli studi, recentemente pubblicati sui bioisosteri dei flavonoidi8, 9, abbiamo voluto verificare l’ipotesi che, analogamente ai composti naturali quali resveratrolo, quercetina e apigenina, questa classe dibioisosteri, in particolare quello che si è precedentemente rivelato più efficace, il 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-3-phenyl-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one (composto6), potrebbe efficacemente inibire l’espressione endoteliale diIL-6 ed MCP-1, stimolata da TNF-α. Inoltre abbiamo voluto indagare alcuni meccanismi di trasduzione del segnale su cui potrebbero esercitare la loro azione, focalizzando la nostra attenzione sul fattore di trascrizione NF-κB. Il composto 6, è stato sintetizzato presso il Dipartimento di Farmacia (brevetto: MI20120514). Il mio lavoro di tesi si è svolto presso l’Istituto di Fisiologia Clinica e si inserisce nell’ambito del progetto di ricerca “MICROsystems for VAsculardiagnosticS and inTervention” (Micro-Vast), finanziato dalla Fondazione Pisa e a cui collaborano diversi partners, fra cui il gruppo del Dipartimento di Farmacia che si occupa della sintesi di nuovi agenti terapeutici vascolari ed il gruppo di biologi dell’Istituto di Fisiologia Clinica, con cui ho svolto il lavoro di tesi, che ne valuta l’efficacia. METODI Sono state utilizzate cellule endoteliali umane ottenute da vena di cordone ombelicale. E’ stato utilizzato il TNF-α come stimolo infiammatorio a 1 e 10 ng/mL, in costimolazione con il composto 6 oppure con il resveratrolo, la quercetina o l’apigenina, utilizzate fino a 10µmol/L o a volte 50 µmol/L. L’espressione della IL-6 e MCP-1 sono stati valutati mediante saggi immunoenzimatici (sandwich ELISA kits) (Quantikine, R&D systems, Inc. Minneapolis, MN USA) sul surnatante cellulare. Il dosaggio della forma fosforilata di NF-kB è stato eseguito mediante un sandwich ELISA kit (PathScanPhospho-NF-κB p65 (Ser536), Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), e mediante western blotting dei lisati cellulari. L’espressione totale della subunità p65 di NF-κB è stata valutata mediante western blotting. RISULTATI Poiché il composto 6 è strutturalmente correlato ai flavonoidi, abbiamo valutato la sua efficacia confrontandola a quella di due noti flavonoidi (apigenina e quercetina) ed il polifenolo antiossidante resveratrolo, presente nella dieta mediterranea. Il composto 6, a 10 μmol/L, inibiva significativamente l’espressione della citochina infiammatoria IL-6, indotta per 24 ore di stimolazione con il TNF-α (10ng/mL) e rilasciata nel surnatante delle colture endoteliali. Tale inibizione era comparabile a quella dell’apigenina e quercetina ma inferiore a quella del resveratrolo, alle medesime concentrazioni utilizzate. Il composto 6 inibiva anche l’espressione della citochina chemiotattica MCP-1, indotta dal TNF-α(10ng/mL) per 24 ore. La sua azione era confrontabile a quella della quercetina, ma non all’apigenina ed al resveratrolo, che risultavano totalmente inefficaci sull’espressione indotta di MCP-1. La ricerca sui meccanismi intracellulari mediati dal TNF-α in presenza dei suddetti composti, ha rivelato che il composto 6inibiva la fosforilazione della subunità p65 del fattore di trascrizione NF-κB, limitandone la traslocazione nel nucleo e la conseguente attivazione genica. Tale inibizione era confrontabile a quella dell’apigenina ma superiore a quello della quercetina. CONCLUSIONI Nel presente studio abbiamo dimostrato che il composto6 inibisce l'espressione di MCP-1 indotta dal TNF-α nelle cellule endoteliali, ad una concentrazione pienamente coerente con il suo uso in vivo. Il composto 6 riduce anche i livelli di IL-6 indotti dal TNF-α.Il composto 6 modula l’attivazione endoteliale indotta dal TNF-αcompatibilmente attraverso l’inibizione dell’attività trascrizionale di NF-κB. I nostri risultati suggeriscono di implementare lo sviluppo dell’intera classe di 2,3-difenilpirido [1,2-a] pirimidin-4-oni nella prevenzione della disfunzione endoteliale. Questi composti potrebbero essere utilizzati come integratori alimentari allo scopo di coadiuvare ed integrare l'efficacia dei flavonoidi naturali