The Molten Globule State of Maltose-Binding Protein: Structural Characterization by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy

Wie Proteine sich innerhalb weniger Millisekunden korrekt falten können, ist eine der fundamentalen Fragen in der Biochemie. Ein beim Faltungsprozess durchlaufener Übergangszustand ist der molten globule Zustand (MG Zustand), der sich unter bestimmten Bedingungen stabilisieren und untersuchen lässt. In diesem Zustand ähnelt die Sekundärstruktur dem nativen Zustand, während die Tertiärstruktur eher dem vollständig entfalteten Zustand entspricht. In dieser Arbeit wurde der MG Zustand am Beispiel des Maltose bindenden Proteins (MBP) untersucht. Dazu wurde MBP bei pH 3,2 im MG-Zustand stabilisiert und dies mittels Fluoreszenz Spektroskopie bestätigt. Die Abstände zwischen definierten Aminosäuren im MG Zustand wurden durch Spinlabels, die an gezielt mutierten Cysteinpaaren angebracht wurden, mittels Elektronenspinresonanz (EPR) gemessen und mit den Abständen derselben Aminosäuren im nativen Zustand verglichen. Anhand von sieben verschiedenen Doppelmutanten wurde die periphere Struktur mittels gepulster EPR analysiert, zwei weitere Doppelmutanten dienten dazu, die Struktur der molekularen Bindungstasche von MBP mittels CW EPR zu untersuchen. Die Anwesenheit von Maltose führte im MG Zustand zu einer deutlichen Veränderung der Abstände bestimmter Spinlabels in der peripheren Struktur. Dies deutet darauf hin, dass MBP Maltose sogar im MG Zustand binden kann. Durch isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde diese Vermutung bestätigt: die Ergebnisse zeigen jedoch, dass der Bindungsprozess zwischen MBP und Maltose im MG Zustand mit 11 fach geringerer Bindungsenthalpie erfolgt wie im nativen Zustand. Die Abstände der Spinlabel Paare neben der Bindungstasche von MBP unterschieden sich im MG Zustand vom nativen Zustand weder mit noch ohne Maltose. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass MBP im MG Zustand rund um die Bindungstasche bereits eine klar ausgebildete Tertiärstruktur besitzt. Um diese Befunde zu bestätigen, sollten nun Untersuchungen anhand weiterer Doppelmutanten und mittels empfindlicherer Messungen wie z.B. DQC durchgeführt werden