Bestimmung von Nikotin, Cotinin und Nikotin-N-Oxid in menschlichem Blut, Plasma, Urin, Sperma und Spermien durch LC-Orbitrap MS: Anwendung in der klinischen Studie

In dieser Arbeit wurde eine durchsatzstarke, robuste, einfache und ökonomische bioanalytische Methode für die simultane Analyse von Nikotin (Nic), Cotinin (Cot) und Nikotin N-oxid (Nox) in menschlichem Urin, Plasma, Samenflüssigkeit, Sperma und getrockneten Blutproben (engl. dried blood spot, DBS) mit LC-ESI-orbitrap-MS entwickelt und validiert. Zum Ausfällen der Proteine wurde ein einzelner Extraktionsschritt mit Trichloressigsäure (TCA) eingesetzt und als interner Standard (IS) diente deuteriertes Nicotin (nicotine-d3). Die entsprechend der europäischen und amerikanischen Richtlinie für bioanalytische Methodenvalidierung hinsichtlich Spezifität, Matrixeffekt, Linearität, Sensitivität, Präzision, Genauigkeit und Lagerstabilität validierte Methode zeigt hohe Wiederfindungsraten, weist kurze Analysenzeiten auf und liefert akkurate Massen der Analyten. Nach Optimierung der chromatographischen Bedingungen wurde eine Kinetex-C18 Säule (150 x 2.1 mm, 5 µm) mit Methanol:Wasser:Ameisensäure (10:90:0,1 %, v/v/v) als Laufmittel eingesetzt. Mittels ESI-orbitrap-MS wurden akkurate Massen im Positivmodus aufgenommen. Bei der Auswertung wurden die m/z-Verhältnisse 163,1235, 177,1028, 179,1188 und 166,1423 für die Substanzen Nic, Cot, Nox bzw. IS herangezogen. Der lineare Bereich für Nic, Cot und Nox in Urin lag bei 50-3000 ng/mL. In Plasma, Samen und bei den DBS wurde ein linearer Bereich von 5-250 ng/mL für Nic und Nox sowie von 10-500 ng/mL für Cot festgestellt. Präzision und Genauigkeit der Messungen entsprachen den Kriterien der angewandten Richtlinien und die Wiederfindung nach der Extraktion lag für alle Matrices bei über 95 %. Die Ionensuppression wurde für alle untersuchten Matrices getestet und bewertet. Mit der entwickelten Methode wurden in dieser Arbeit drei Fragestellungen bearbeitet. Als erstes wurde der Einfluss von Granatapfel- und Lakritzgetränken auf die Metabolisierungsrate von Nikotin anhand von Bestimmungen des metabolischen Index Nic/Cot sowie eines zusätzlichen neuen, in dieser Arbeit erstmalig verwendeten Index Nic/Nox, in Urin untersucht. Im Vergleich mit den entsprechenden Kontrollbedingungen zeigte sich bei den 24 Raucherprobanden unter dem Einfluss von Granatapfel- und Lakritzgetränken eine beschleunigte Metabolisierungsrate von Nikotin. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Gehalt von Nikotin und seinen Hauptmetaboliten Cotinin und Nikotin-N-Oxid in menschlichem Plasma, Samenflüssigkeit und Sperma untersucht. Nikotin verbreitet sich im menschlichen Körper in Flüssigkeiten und Geweben, aber es ist bisher nicht bekannt, ob Nikotin in Sperma vorhanden ist. Dazu wurden Spermienzellen aus je 1 mL Spermienflüssigkeit von 12 Probanden durch Zentrifugation quantitativ abgetrennt und mittels der optimierten Methode extrahiert. Nikotin und Cotinin wurde in allen Proben detektiert. In Plasma lag der Gehalt von Nikotin-N-Oxid unterhalb der Quantifizierungsgrenze, in allen Samenflüssigkeitsproben und in 10 von 12 Spermaproben konnte Nox aber detektiert werden. Der Nikotin- und Cotiningehalt in Sperma war mit dem Gehalt in Plasma vergleichbar. In Samenflüssigkeit war der Gehalt an Nikotin signifikant höher als in Plasma (2,3-fach, p<0.001). Im Sperma lag die Konzentration von Nic und Cot im gleichen Bereich wie für Nic im Plasma. Die Nic-Konzentrateion im Sperma war jedoch signifikant niedriger als in der Samenflüssigkeit (2,1-fach, p<0,001). Im dritte Teil dieser Arbeit wurde eine bioanalytische Methode unter Verwendung von getrockneten Blutproben (DBS) als Alternative für traditionell eingesetzte Methoden entwickelt. Die auf Filterpapieren getrockneten Blutproben wurden als Plättchen von 6,35 mm Durchmesser ausgestanzt und mit Trichloressigsäure in einem einzelnen Extraktionsschritt extrahiert. Die Untersuchung chromatographischer Effekte zeigte, dass Variationen der DBS Methode durch nicht exakt zentriertes Ausstanzen der Bluttropfen und hämatokritische Effekte nur zu minimalen Schwankungen der ermittelten Nikotin- und Cotiningehalte führen. Anschließend wurde die optimierte Methode auf Blutproben von zwölf Rauchern angewandt und die Messungen mittels DBS wurden mit den entsprechenden Plasmaproben verglichen.A high throughput, robust, simple, and economic bioanalytical method for simultaneous determination of nicotine (Nic), cotinine (Cot) and nicotine N-oxide (Nox) in human urine, plasma, semen, sperm and dried blood spot (DBS) was developed and validated by LC ESI-orbitrap-MS. The current described method was successfully developed using deuterated nicotine (nicotine-d3) as internal standard (IS) following single extraction step by trichloroacetic acid solution (TCA) for protein direct precipitation, providing top extraction recovery and short run time with accurate mass measurements. The method was then validated according to the European and American guideline for bioanalytical method validation in terms of specificity, matrix effect, linearity, sensitivity, precision, accuracy and stability. Chromatographic conditions were optimized using Kinetex-C18 column (150 × 2.1mm, 5µm) and eluted by mobile phase of methanol:water:formic acid (10:90:0.1%, v/v/v). Accurate mass measurements were obtained by ESI-orbitrap-MS at positive m/z 163.1235, 177.1028, 179.1188 and 166.1423 for Nic, Cot, Nox and IS, respectively. The established calibration range for Nic, Cot and Nox in urine analysis was linear between 50 and 3000 ng/mL, in plasma, semen and DBS was linear between 5-250 ng/mL for Nic and Nox, and between 10-500 ng/mL for Cot. The within and between days measurements precision and accuracy were all within the acceptance criteria according to the European and American guidelines for bioanalytical method validation, and the extraction recovery was higher than 95% for the studied matrixes. The ionic suppression test was achieved and discussed for the all investigated fluidic matrices. The established method was intended to investigate three objectives, including study the influence of pomegranate and licorice test drinks on Nic metabolism rate. This was done by urinary measurements for metabolic index of Nic/Cot, in addition to new introduced metabolic index Nic/Nox, where urine samples were collected from twenty four smoker volunteers under pomegranate and licorice drink conditions, and compared their measurements to corresponding control condition. The second study objective was intended to investigate Nic with its major metabolites Cot and Nox availability in human plasma, semen and sperm, where Nic has extensive distribution among human fluids and tissues, but still nobody knows whether Nic is available in sperm or not. Herein, sperm bodies were separated quantitatively from each 1 mL of twelve human’s semen samples by centrifugation and extracted. As a result, Nic and Cot were detected in all samples, and Nox was below the LLOQ in plasma but detectable in all semen samples and 10 out of 12 sperm samples. Interestingly, Nic was significantly higher in semen compared to plasma (2.3-fold, p<0.001). The measured Nic and Cot concentrations in sperm samples were comparable to the corresponding measurements in plasma, and Nic was significantly lower in sperm compared to semen (2.1-fold, p