Molecular characterisation of the cowpea mosaic virus movement protein

<p>Virussen zijn subcellulaire parasieten die niet zelfstandig kunnen bestaan, maar cellen binnendringen en cellulaire mechanismen van hun gastheer gebruiken voor vermenigvuldiging. Virussen zijn verantwoordelijk voor vele ernstige ziektes bij mensen en dieren (zoals bijvoorbeeld griep, verkoudheid of AIDS), maar ook bij planten, waar virussen verantwoordelijk kunnen zijn voor de vernietiging van hele oogsten. Virussen zijn vrij eenvouding van structuur en bevatten een kleine hoeveelheid genetisch materiaal, dat uit DNA of RNA kan bestaan. Dit genoom is omgeven door een beschermende eiwitlaag, de mantel.</p><p>Terwijl dierlijke virussen normaal cellen binnenkomen via chemische interacties met specifieke herkenningsmoleculen (receptoren) in de celmembraan, zijn celmembranen van plantencellen omhuld door een pantserbekleding van cellulose die een ondoordringbare hindernis vormt voor plantenvirussen. De meeste virussen kunnen een plant pas binnendringen na mechanische beschadiging of met behulp van een biologische vector (b.v. een bladluis of een ander insect) die de virussen tijdens het voeden rechtstreeks in een gastheercel binnenbrengen. In zo een initiëel geïnfecteerde cel wordt het virale genoom, dat uit één of meerdere DNA of RNA moleculen kan bestaan, vertaald in virale eiwitten die zorg dragen voor de replicatie van het virale genoom en de bemanteling van het virale RNA. Na deze vermenigvuldigingsstap verspreidt het virus zich verder door de plant en zal in eerste instantie de naburige cellen infecteren (via het zogeheten lokaal transport of cel-cel transport). Nadat een infectie de vaatbundels bereikt heeft, zullen virusdeeltjes zich via de vaatbundels door de rest van de plant verspreiden (het lange-afstands transport). In de hoger gelegen bladeren treedt het virus de vaatbundels weer uit, en verspreidt het zich opnieuw via cel-cel transport naar andere cellen van dat blad.</p><p>Als een virus zich vanuit een initiëel geïnfecteerde cel naar naburige cellen wil verspreiden, stuit het opnieuw op de ondoordringbare celwand. Deze hindernis wordt met behulp van een speciaal mechanisme omzeilt. In de celwand zitten nauwe kanaaltjes, de plasmodesmata, die naburige cellen met elkaar verbinden. Deze kanaaltjes spelen een rol bij de verspreiding van (voedings)stoffen en worden door de plant gebruikt voor intercellulaire communicatie. Virussen zouden deze plasmodesmata kunnen gebruiken voor lokaal transport, ware het niet dat ze te groot zijn om door de kanaaltjes heen te kunnen gaan. De oplossing die virussen hebben ontwikkeld om dit probleem te omzeilen is even elegant als simpel: ze coderen voor een specifiek eiwit (het transporteiwit, afgekort MP voor het Engelse "movement protein"), die de diameter van plasmodesmata kan vergroten, waardoor transport van virusdeeltjes of complexen van viraal RNA en MP mogelijk wordt. In <strong>hoofdstuk 1</strong> wordt een overzicht gegeven van virale MPs en de verschillende mechanismen die plantenvirussen hebben ontwikkeld om zich van cel naar cel te verspreiden.</p><p>Dit proefschrift beschrijft een onderzoek waarin het MP van het koebonenmozaïekvirus (op z'n Engels "cowpea mosaic virus" (CPMV) geheten) centraal staat. Dit virus infecteert voornamelijk tropische planten, waaronder kouseband ( <em>Vigna unguiculata</em> ), een plant waarvan de peulen vooral in Afrika en Zuid-Amerika een belangrijke voedingsmiddel zijn (kouseband is ook in Nederland op veel plaatsen te koop; voor een tip hoe deze te bereiden, kan de auteur van dit proefschrift benaderd worden). Een infectie van kouseband door CPMV wordt gekenmerkt door de vorming van milde tot hevige mozaïek-symptomen op geïnfecteerde bladeren, die tot afsterven van het blad kan leiden. Het genoom van CPMV bestaat uit een tweetal enkelstrengs RNA moleculen met een positieve polariteit. Deze RNA moleculen worden in een geïnfecteerde cel vertaald in een drietal polyeiwitten, die door een viraal enzym in stukken worden geknipt tot kleinere producten. De door het RNA1 gecodeerde eiwitten zijn betrokken bij de virale replicatie. De eiwitten die gecodeerd worden door RNA2, spelen een rol bij het cel-cel en het lange-afstands transport van CPMV. Dit zijn de twee manteleiwitten LCP en SCP, een 58K eiwit, dat nodig is voor replicatie van RNA2 en het MP.</p><p>Met behulp van electronen-microscopische analyse zijn in CPMV-geïnfecteerd weefsel buisvormige structuren aangetroffen, die gevuld zijn met virusdeeltjes. Deze buizen steken door een gemodificeerde plasmodesma van een geïnfecteerde cel in het cytoplasma van een naburige cel. Soortelijke structuren zijn aangetroffen in protoplasten (geïsoleerde plantencellen) die geïnfecteerd zijn met CPMV en in protoplasten of insectencellijnen waarin alleen het MP specifiek tot expressie is gebracht. Deze experimenten laten zien dat voor de vorming van de buizen geen plasmodesmata nodig zijn. Biochemische analyse van de buizen heeft laten ziendat de buizen grotendeels of zelfs helemaal zijn opgebouwd uit het MP.</p><p>Het proces van buisvorming gebeurd waarschijnlijk in een aantal stappen. Nadat het MP aangemaakt is in virale replicatie complexen moet het naar de celmembraan getransporteerd worden, waar het zich bij plasmodesmata zal ophopen en een buis zal vormen. Tijdens deze buisvorming worden de virusdeeltjes in de buis ingebouwd. De plasmodesma waarin de buis wordt gevormd, wordt drastisch gemodificeerd. Verschillende gebieden (domeinen) van het MP zullen een specifieke rol hebben en betrokken zijn bij een of meerdere van de hierboven beschreven stappen. In <strong>hoofdstuk 2</strong> hebben we getracht zulke domeinen te vinden door met behulp van moleculair-biologische technieken mutaties aan te brengen binnen het MP en het effect hiervan op onder andere de buisvorming te onderzoeken. Uit de resultaten blijkt dat het resultaat van een subtiele mutatie heel drastisch kan zijn. Sommige mutaties hebben tot gevolg dat het MP geen buizen meer kan vormen. Virussen die dit mutant MP bezitten zijn niet meer in staat om zich te verspreiden in planten. Mutaties aangebracht op andere plaatsen in het MP lijken nauwelijks effect te hebben op de eigenschappen van het transporteiwit. We hebben ontdekt dat het N-terminale en het centrale deel van het MP nodig zijn voor het transport naar de plasmodesmata en voor de vorming van de buizen.</p><p>Het volgen van een virusinfectie in levende planten is erg moelijk. Virussen zijn alleen maar te zien onder een electronenmicroscoop waarvoor men echter de delen van de plant die men wil onderzoeken moet fixeren. Door deze behandeling sterven de plantcellen en kunnen er allerlei ongewilde veranderingen (artefacten) optreden in het weefsel. Een paar jaar terug is er een nieuwe methode ontwikkeld om een virusinfectie in levende planten te volgen. Men maakt hiervoor gebruik van een fluorescent eiwit, het "green fluorescent protein" (GFP). Dit eiwit komt van nature voor in kwallen en heeft de bijzondere eigenschap om groen op te lichten (te fluoresceren) indien het wordt beschenen met UV-licht. Met behulp van moleculair-biologische technieken is dit GFP ingebouwd in CPMV. Als we planten hiermee infecteren, kunnen we de infectie in de tijd volgen door de planten onder een UV-lamp of onder een fluorescentie-microscoop te onderzoeken, zoals staat beschreven in de hoofdstukken 3 en 4.</p><p>In <strong>hoofdstuk 3</strong> hebben we ons geconcentreerd op het C-terminale deel van het MP. Door de analyse van deletie-mutanten en hybride MPs (bestaande uit delen van het MP van het rode-klavervlekkenvirus en dat van CPMV) was het mogelijk om bijna op het aminozuur nauwkeurig de grens aan te geven van het domein dat betrokken is bij de vorming van buizen. De buizen gevormd door een MP mutant, waarin de laatste 10 aminozuren waren vervangen door GFP, bleken geen virusdeeltjes te bevatten. Blijkbaar blokkeert GFP het functioneren van een MP domein dat betrokken is bij de inbouw van virusdeeltjes in buizen. Indien een virus naast wild-type (normaal) MP ook een mutant MP (die geen functionele C-terminus heeft) bezit, verspreidt het virus zich toch door de plant. De buizen, die waarschijnlijk zowel uit het wild-type alsook het mutant MP bestaan, zijn niet helemaal netjes gevuld met virusdeeltjes. Af en toe lijkt er wat ruimte tussen de verschillende deeltjes te zitten. Deze resultaten geven aan dat alle C-termini nodig zijn voor het virale transport.</p><p>Een van de bijzondere eigenschappen van GFP is, dat na fusie van GFP aan een ander eiwit (b.v. het MP), de intracellulaire localisatie van dat eiwit kan worden bekeken in levend materiaal. In <strong>hoofdstuk 4</strong> hebben we de intracellulaire locatie van een aantal fusieproducten tussen GFP en het CPMV MP nader onderzocht. In eerste instantie hebben we een fusie gemaakt tussen het wild-type MP en GFP. Een virus coderend voor dit MP:GFP fusieproduct was in staat (fluorescente) buizen te maken in protoplasten. In planten hoopt het MP:GFP zich op als opvallende punten (spots) in de celwand. Deze plaatsen zijn waarschijnlijk de eerder aangehaalde gemodificeerde plasmodesmata, waar cel-cel verspreiding van het virus plaatsvindt. In sommige gevallen werden zelfs fluorescente buizen in de celwand aangetroffen. De infectie van dit genetisch gemodificeerde virus bleek echter beperkt tot enkele cellen. Vervolgens zijn een aantal van de in hoofdstuk 2 gekarakteriseerde MP mutanten gefuseerd aan GFP en is de localisatie van deze mutant MP:GFP eiwitten bekeken in protoplasten en planten. MPs die een mutatie bevatten in hun centrale deel bleken verstoord te zijn in het intracellulaire transport naar de celmembraan en hoopten zich op in het cytoplasma. Een van de mutant MP:GFPs hoopte zich tevens op in structuren die in de buurt van de celkern in het cytoplasma liggen. Waarschijnlijk zijn dit virale replicatie-complexen en is dit mutant MP:GFP niet in staat zich hieruit los te maken. Mutante MP:GFPs met veranderingen in het C-terminale deel van het MP werden wel naar de celmembraan getransporteerd, maar waren verstoord in de initiatie of elongatie van de buizen.</p><p>We kunnen concluderen dat het in dit proefschrift beschreven onderzoek heeft geleid tot een beter inzicht in het mechanisme dat CPMV gebruikt voor zijn cel-cel verspreiding. Middels mutatie-analyse en door gebruik te maken van GFP hebben we een aantal functionele domeinen van het CPMV MP geïdentificeerd. We kunnen het MP grofweg in twee functionele domeinen verdelen. Een groot deel van de N-terminale en centrale gebieden van het eiwit zijn betrokken bij de vorming van buisvormige structuren in protoplasten en planten. Dit domein is onder te verdelen in gebieden die betrokken zijn bij het intracellulaire transport naar de plasmodesmata toe en in gebieden die een rol spelen bij de initiatie van buisvorming. Het C-terminale deel is niet betrokken bij buisvorming, maar speelt een rol bij de inbouw van virusdeeltjes in de buizen. De in dit proefschrift beschreven resultaten zullen worden gebruikt voor vervolgstudies, die onder andere gericht zullen zijn op de identificatie van gastheer-eiwitten die een interactie aangaan met het CPMV MP en op het ophelderen van het intracellulaire transport van het MP.