Perinatal regulation of lung liquid absorption in pulmonary adaptation in newborn infants

Respiratory distress is a major contributor to morbidity in newborn infants. Insufficient clearance of lung liquid at birth causes maladaptation (transient tachypnea of the newborn, TTN) primarily in late preterm (delivery at 34 0/7 to 36 6/7 gestational weeks) and term infants. In small preterm infants excess lung liquid further complicates respiratory distress syndrome (RDS) caused by a lack of pulmonary surfactant. Importantly, the risk of respiratory morbidity remains elevated in early term infants (i.e. delivery at 37 0/7- 38 6/7 gestational weeks), especially if delivered by elective cesarean section (CS). Thus, major risk factors for respiratory morbidity include preterm delivery or delivery by elective CS. In both prematurity and CS, the hormonal milieu of the fetus, important in adaptation to air-breathing, differs from that of the term vaginally delivered infants. In particular, glucocorticoids (GCs) play an important role in the maturation of the fetal lung. GCs are often administered antenatally to mothers at risk of preterm delivery as an attempt to reduce respiratory morbidity in their preterm infants. Although relevant to preventive and treatment strategies for respiratory distress in newborn infants, data on airway ion and liquid transport and their hormonal regulation in human infants are limited. Therefore, the aim of this thesis was to acquire new data on lung liquid clearance and its molecular mechanisms in newborn infants. In particular, we studied their hormonal regulation during pulmonary adaptation. We used ultrasound to estimate the amount of lung liquid in term newborn infants, and compared infants delivered vaginally (VD) and by elective CS. The gene expression of the epithelial sodium channel (ENaC), Na-K-ATPase and serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) were determined in airway epithelial cells from nasal epithelium, used as a surrogate for the lower airway epithelium. Gene expression was quantified by measuring mRNA levels of these genes with a real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. We determined the concentration of cortisol hormone in umbilical cord blood and saliva with liquid-chromatography tandem-mass spectrometry or enzyme-linked immunosorbent assay. The relationship of ENaC, Na-K-ATPase and SGK1 gene expression with cortisol was studied in cohorts of late preterm and term infants. In preterm infants, we studied the effect on airway ENaC expression of a repeated antenatal dose of the glucocorticoid betamethasone to the mother. The term infants and the majority of the preterm infants in the studies were born at the Women’s Hospital, Helsinki University Hospital. The lung liquid content of the term, healthy infants at three hours postnatally was significantly higher in infants delivered by elective CS than in VD infants. The umbilical cord cortisol concentration was lower in CS than in VD infants, and CS was associated with lower SGK1 expression at 1.5 hours after delivery. At this time point, the airway expression of ENaC, Na-K-ATPase, and SGK1 was lower in infants delivered late preterm and early term than in infants delivered ≥ 39 weeks. In addition, ENaC expression of late preterm and term infants correlated positively with umbilical cord blood and salivary cortisol concentrations. However, a repeat antenatal dose of betamethasone to the mother had no significant effect on ENaC expression in the preterm infants. This thesis work confirms that compared with infants delivered vaginally the amount of lung liquid remains more abundant after CS, and that ultrasound is a useful tool for evaluating lung liquid content in newborns. Low SGK1 expression after CS delivery and lack of labor could contribute to the insufficient activation of transmembrane sodium transport causing defective liquid absorption. In infants delivered < 39 weeks of gestation airway epithelial amounts of ENaC, Na-K-ATPase, and SGK1 mRNAs were all lower than in those delivered ≥ 39 weeks. These physiological data are in line with the epidemiologic evidence of a higher risk for respiratory morbidity in infants delivered before 39 weeks of gestation, especially when delivered by CS. Thus, our data support the practice of postponing elective CS until 39 weeks. Our findings provide valuable information for planning strategies aimed at preventing or treating respiratory distress in preterm and term infants.Hengitysvaikeudet aiheuttavat merkittävää sairastuvuutta vastasyntyneillä lapsilla. Täysaikaisilla ja lievästi ennenaikaisilla (syntymä raskausviikoilla 34 0/7-36 6/7) lapsilla puutteellinen keuhkojen nesteenpoisto voi aiheuttaa ongelmia sopeutumisessa hengittämään ilmaa, eli keuhkoadaptaatiohäiriöön. Pienillä keskosilla riittämätön nesteenpoisto keuhkoista pahentaa puutteellisesta keuhkorakkuloiden pintajännitystä vähentävän surfaktantin määrästä ja toiminnasta johtuvaa hengitysvajausta. Ennenaikaisuus ja syntymä keisarileikkauksella lisäävät hengitysvaikeuksien riskiä. Riski on kuitenkin lievästi suurentunut myös ennen laskettua aikaa raskausviikoilla 37 0/7- 38 6/7 syntyneillä lapsilla. Vastasyntyneen lapsen sopeutuminen hengittämään ilmaa alkaa hormonaalisen säätelyn ansiosta jo sikiöaikana. Ennenaikaisesti tai keisarileikkauksella syntyvien lasten hormonaaliset vasteet poikkeavat kuitenkin täysiaikaisina ja alateitse syntyvien lasten vasteista. Glukokortikoidihormonit ovat erityisen tärkeitä sikiön keuhkojen kypsymisen kannalta. Glukokortikoidivalmistetta voidaankin antaa äidille ennen uhkaavaa ennenaikaista (esimerkiksi ennen raskausviikkoa 35 tapahtuvaa) synnytystä ehkäisemään keskosten hengitysvaikeuksia. Hengitysteiden pintaa verhoavien solujen natrium-, kalium- ja kloridi-ionien kuljetus ja siitä johtuva veden osmoottinen imeytyminen sekä näiden hormonaalinen säätely ovat tärkeitä hengitysvaikeuksien ennaltaehkäisevien tai hoidollisten toimien kannalta. Nämä mekanismit on selvitetty pääosin eläinmalleilla ja solutöillä, mutta vastasyntyneillä lapsilla asia tunnetaan huonosti. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli arvioida vastasyntyneillä lapsilla keuhkojen nesteenpoistoa, sen imeytymiseen osallistuvien suolakanavien geenien ilmentymää eli lähetti-RNA:n määrää ja näiden säätelyä keuhkoadaptaation aikana. Arvioimme täysiaikaisten lasten keuhkonesteen määrää ultraäänen avulla. Määritimme keuhkojen limakalvon ionien kuljetukseen osallistuvien (epiteliaalinen natriumkanavan eli ENaC ja Na-K-ATPaasin) ja siihen vaikuttavien (serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 eli SGK1) molekyylien geeni-ilmentymät. Mittasimme kortisolihormonin pitoisuudet napaveressä ja syljessä. Keskosilla tutkimme äidille ylimääräisenä annoksena annetun beetametasoni-glukokortikoidin vaikutusta hengitystie-epiteelin ENaC-suolakanavan geeni-ilmentymään. Täysiaikaiset lapset ja valtaosa ennenaikaisista lapsista syntyivät Helsingin yliopistollisen sairaalan Naistenklinikalla. Keisarileikkauksella syntyneillä terveillä täysiaikaisilla lapsilla keuhkojen nestemäärä kolme tuntia syntymän jälkeen oli suurempi kuin alateitse syntyneillä lapsilla. Täysiaikaisilla lapsilla napaveren kortisolipitoisuus ja hengitysteiden SGK1 geenin ilmentymä pian syntymän jälkeen oli matalampi keisarileikkauksen kuin alatiesynnytyksen jälkeen. Tutkimamme hengitysteiden veden imeytymiseen vaikuttavien molekyylien geeni-ilmentymät olivat matalammat lievästi ennenaikaisesti sekä raskausviikoilla 37 0/7- 38 6/7 syntyneillä kuin raskausviikolla 39 ja sen jälkeen syntyneillä lapsilla. Lievästi ennenaikaisilla ja täysiaikaisilla lapsilla ENaC-geenien hengitysteiden limakalvon lähetti-RNA:n määrä oli sitä suurempi mitä korkeampi napaveren tai syljen kortisolipitoisuus oli. Ylimääräisellä annoksella beetametasonia ei kuitenkaan ollut vaikutusta ennenaikaisesti syntyneiden lasten ENaC:in geeni-ilmentymään. Tämä väitöskirja vahvistaa, että vastasyntyneen lapsen keuhkojen nestemäärä on suurempi keisarileikkauksen kuin alatiesynnytyksen jälkeen. Keisarileikkauksella syntyneillä lapsilla esimerkiksi matalaan kortisolipitoisuuteen liittyvä matala SGK1-geenin ilmentymä saattaa vähentää hengitysteiden limakalvon natriumin kuljetusta ja siten huonontaa keuhkonesteen imeytymistä. Lisäksi puutteellinen keuhkonesteen poisto saattaa liittyä siihen, että ennen raskausviikkoa 39 hengitysteiden natriumionien kuljetukseen vaikuttavien molekyylien geeni-ilmentymät olivat matalat. Nämä havainnot ovat yhteneväisiä epidemiologisten tutkimusten kanssa, joiden mukaan hengitysvaikeuksien riski on erityisen suuri, jos lapsi syntyy keisarileikkauksella ennen raskausviikkoa 39. Löydöksemme puoltaa näkemystä, että suunniteltu keisarileikkaus tulisi suorittaa hyvin lähellä täysiaikaisuutta, eli raskausviikolla 39 tai sen jälkeen. Tuloksemme voivat antaa tukea kehitettäville keskosten ja täysiaikaisten lasten hengitysvaikeuksia ennaltaehkäiseville tai hoidollisille strategioille