Reavaliação do diagnóstico molecular de Streptococcus pneumoniae

Mestrado em Biologia Molecular e CelularStreptococcus pneumoniae is a human pathobiont that colonizes the nasopharynx. S. pneumoniae is responsible for causing non-invasive and invasive disease such as otitis, pneumonia, meningitis, and sepsis, being a leading cause of infectious diseases worldwide. Due to similarities with closely related species sharing the same niche, it may be a challenge to correctly distinguish S. pneumoniae from its relatives when using only non-culture based methods such as real time PCR (qPCR). In 2007, a molecular method targeting the major autolysin (lytA) of S. pneumoniae by a qPCR assay was proposed by Carvalho and collaborators to identify pneumococcus. Since then, this method has been widely used worldwide. In 2013, the gene encoding for the ABC iron transporter lipoprotein PiaA, was proposed by Trzcinzki and collaborators to be used in parallel with the lytA qPCR assay. However, the presence of lytA gene homologues has been described in closely related species such as S. pseudopneumoniae and S. mitis and the presence of piaA gene is not ubiquitous between S. pneumoniae. The hyaluronate lyase gene (hylA) has been described to be ubiquitous in S. pneumoniae. This gene has not been used so far as a target for the identification of S. pneumoniae. The aims of our study were to evaluate the specificity, sensitivity, positive predicted value (PPV) and negative predicted value (NPV) of the lytA and piaA qPCR methods; design and implement a new assay targeting the hylA gene and evaluate the same parameters above described; analyze the assays independently and the possible combinations to access what is the best approach using qPCR to identify S. pneumoniae. A total of 278 previously characterized strains were tested: 61 S. pseudopneumoniae, 37 Viridans group strains, 30 type strains from other streptococcal species and 150 S. pneumoniae strains. The collection included both carriage and disease isolates. By Mulilocus Sequence Analysis (MLSA) we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae when lytA qPCR assay is used. The results showed that as a single target, lytA had the best combination of specificity, sensitivity, PPV and NPV being, 98.5%, 100.0%, 98.7% and 100.0% respectively. The combination of targets with the best values of specificity, sensibility, PPV and NPV were lytA and piaA, with 100.0%, 93.3%, 97.9% and 92.6%, respectively. Nonetheless by MLSA we confirmed that strains of S. pseudopneumoniae could be misidentified as S. pneumoniae and some capsulated (23F, 6B and 11A) and non-capsulated S. pneumoniae were not Identified using this assay. The hylA gene as a single target had the lowest PPV. Nonetheless it was capable to correctly identify all S. pneumoniae.Streptococcus pneumoniae é uma bactéria patogénica que coloniza a nasofaringe humana. S. pneumoniae é responsável por causar doenças, tanto invasivas como não invasivas como: otite, pneumonia, meningite e sepsis, continuando a ser uma das principais causas de doenças infecciosas a nível mundial. Devido a semelhanças com espécies que lhe são estreitamente relacionadas, e que compartilham o mesmo nicho ecológico, pode ser um desafio identificar corretamente S. pneumoniae aplicando apenas técnicas não dependentes do passo de cultura bacteriana como a técnica de PCR em tempo real (qPCR). Em 2007, um método molecular para identificação de S. pneumoniae baseado num qPCR e tendo como alvo o gene da autolisina principal (lytA) de S. pneumoniae foi proposto por Carvalho e seus colaboradores. Desde então, este tem sido usado de uma forma sistemática por vários grupos. Em 2013, foi proposto por Trzcinszki e seus colaboradores o uso da lipoproteína ABC transportadora de ferro PiaA como alvo num qPCR. O piaA qPCR foi usado em paralelo com o lytA qPCR. Contudo, a presença de genes homólogos de lytA foi descrita em espécies filogeneticamente próximas, como S. pseudopneumoniae e S. mitis, e a presença do gene piaA não é ubíquo entre S. pneumoniae. O gene da proteína hyaluronato lyase (hylA) é descrito como sendo ubíquo a todas as estirpes de S. Pneumoniae. Este gene ainda não foi usado até ao momento como alvo para a identificação de S. pneumoniae. Assim o objectivo do nosso estudo foi a avaliação da especificidade, sensibilidade, valor positivo preditivo (VPP) e valor negativo preditivo (VNP) do método lytA e piaA qPCR; construção de hylA qPCR avaliando os mesmos parâmetros acima referidos; analise dos ensaios de uma forma independente e em conjunto, para poder retirar conclusões sobre qual o melhor gene alvo, ou alvos, a usar na identificação de S. pneumoniae. Foram testadas um total de 278 estirpes anteriormente caracterizadas: 61 S. pseudopneumoniae, 37 estirpes do grupo Viridans, 30 estirpes referência de outras espécies de Streptococcus e 150 estirpes de S. pneumoniae. A coleção usada incluía tanto estirpes obtidas em colonização como estirpes obtidas em doença. Através do método Multilocus sequence analysis (MLSA) verificámos que estirpes de S. pseudopneumoniae podem ser incorretamente identificadas como S. pneumoniae quando é utilizado o lytA qPCR. Ainda assim, os resultados mostraram que como alvo único, o gene lytA apresenta a melhor combinação de valores de especificidade, a sensibilidade, VPP e VNP sendo, respetivamente, 98.5%, 100.0%, 98.7% e 100.0%. A combinação de genes com a melhor combinação de valores de especificidade, sensibilidade, VPP e VNP foi lytA e piaA, com 100.0%, 93.3%, 97.9% e 92.6%, respetivamente. De realçar que pelo método MLSA verificámos que estirpes de S. pseudopneumoniae podem ser incorretamente identificadas como S. pneumoniae e algumas estirpes capsuladas (23F, 6B e 11A) e não-capsuladas de S. pneumoniae não são identificadas quando usada esta combinação de genes. O gene hylA como alvo único apresentou o valor de PPV mais baixo, todavia identificou corretamente todos os S. pneumoniae