Potencial de reparo cutâneo de células-tronco mesenquimais dermais associadas à Nanomatrizes de celulose bacteriana

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016.Lesões de espessura total na pele, como queimaduras extensas e úlceras crônicas, resultam em numerosos problemas fisiológicos, funcionais e psicológicos para os pacientes. Apesar de existirem diversos tratamentos para essas lesões, nenhum deles resulta em uma pele totalmente íntegra e funcional. Por isso, buscou-se com este trabalho um melhor método de reparo cutâneo, associando células-tronco mesenquimais dermais (dCTMs) com matrizes de celulose bacteriana (MCBs). Trabalhos têm mostrado que CTMs melhoram o reparo de tecidos lesados, por meio de sua diferenciação nos fenótipos afetados ou da liberação de fatores parácrinos. As MCBs, por sua vez, são polímeros naturais produzidos por bactérias. Essas membranas são atrativas para o reparo tecidual, por apresentarem características como biocompatibilidade, alta capacidade de retenção de água, e boa permeabilidade. Neste trabalho as MCBs produzidas foram caracterizadas fisicamente em seu estado úmido e liofilizado. As MCBs hidratadas apresentaram uma alta capacidade de retenção de água, fibras nanométricas e porosidade superficial de cerca de 30%. Quando submetidas ao processo de liofilização as MCBs não mantiveram sua conformação tridimensional, apresentando porosidade quase nula, fibras achatadas e baixa taxa de reabsorção de água, não sendo capazes de retornar ao seu estado original. Desse modo, a associação de dCTMs foi analisada apenas com as MCBs hidratadas. As dCTMs foram obtidas a partir de fragmentos de pele, de pacientes saudáveis, que se submeteram a cirurgias de lifting facial, e foram cultivadas sobre as MCBs em condições de cultivo padrão. Os experimentos demonstraram que as dCTMs permaneceram viáveis por 21 dias sobre as MCBs, análises com microscopia de varredura e confocal indicaram que as dCTMs se aderem progressivamente sobre as MCBs, são capazes de se proliferar, não migram para o interior das membranas e mantém sua morfologia típica. Nessas condições as dCTMs também mantiveram suas características imunofenotípicas de CTMs como visto por citometria de fluxo. Esses resultados mostram que as MCBs são biocompatíveis às dCTMs. Considerando estas análises, o potencial terapêutico dessa associação foi avaliado in vivo em lesões cutâneas de camundongos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: taxa de fechamento das lesões, infiltrado inflamatório, angiogênese, espessura e homogeneidade da epiderme e comprimento das cicatrizes. Os resultados revelaram que, quando comparado com o grupo controle, o grupo tratado com dCTM+MCB apresentou um aumento significativo na angiogênese e no infiltrado de neutrófilos. Além disso, o tratamento influenciou a espessura do tecido de granulação, levou a formação de uma epiderme mais fina e homogênea, e aparentemente diminuiu as cicatrizes. Em conjunto, os resultados sugerem que a associação esteja acelerando a maturação das lesões cutâneas, e favorecendo o processo de reparo cutâneo.Abstract : Full-thickness skin injuries, such as extensive burns and chronic ulcers result in numerous physiological functional and psychological problems for the patients. Even though there are various current treatments for these lesions, none of them lead to a fully reconstituted and functional skin. For this reason, this work search for a better method to improve skin repair, associating dermal mesenchymal stem cells (dMSCs) with bacterial cellulose membranes (BCMs). Studies have shown that MSCs improve tissue repair through differentiation in affected phenotypes or by releasing paracrine factors. The BCMs, in turn, are natural polymers produced by bacteria. These membranes are attractive for tissue repair by presenting biocompatibility, high capacity of water retention, and good permeability. In the present work, the produced BCMs were physically characterized in their wet and freeze-dried states. The wet BCMs showed a high capacity for water retention, nanometric fibers and a surface porosity of about 30%. When subjected to the freeze drying process, BCMs did not keep their three-dimensional conformation, presented almost no porosity, flattened fibers and low water absorption rate, not being able to return to its original state. Thus, dMSCs association was analyzed only with wet BCMs. The dMSCs were obtained from fragments of skin of healthy patients who had undergone facelift surgery. The cells were then cultured on BCMs in standard culture conditions. The experiments showed that dMSCs remained viable for 21 days on BCMs. Scanning electron and confocal microscope analyses revealed that dMSCs progressively adhered on BCMs, were able to proliferate, do not migrate to the interior of the matrices and maintained their typical morphology. In this condition, cells maintained the MSCs immunophenotypic characteristics as assessed by flow cytometry. These results show that the MCBs are biocompatible with the dMSCs. Therefore, the therapeutic potential of the dMSCs associated with BCMs was evaluated in vivo, in mice cutaneous lesions. The following parameters were evaluated: closing rate of lesions, inflammatory infiltration, neovascularization, thickness and homogeneity of the epidermis and length of scars. The results revealed that, when compared to the control group, the treated group (MSC+BCM) showed a significant increase in neovascularization and neutrophil infiltration. Besides, the treatment also influenced the thickness of granulation tissue, and allowed the formation of a thin and uniform epidermis. The lenght of scras int he treated gruoup were relatively smaller. Together, the results suggest that the MSC+BCM treatment is accelerating the maturation of skin lesions, and promoting the skin repair process