Caracterização da DICER-LIKE 2 (TrDCL2) de Trypanosoma rangeli

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada.Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated