Desenvolvimento de marcadores moleculares microssatélites e análise da diversidade genética de Guadua chacoensis (Rojas) Londoño & P M.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016.O bambu (Poaceae: Bambusoidae), tem sido utilizado pela humanidade desde tempos remotos até os dias atuais. Historicamente, tem sido cultivado e explorado intensamente em vários países asiáticos, no entanto, vários povos utilizaram as diferentes espécies de bambu como material de construção, utensílios e alimentação, entre outros. No Brasil, existem muitas espécies nativas pertencentes à subfamília Bambusoideae. Entre estas, destaca-se o Guadua chacoensis, pelas suas características morfológicas e de rusticidade no ambiente em que ocorre. Contudo, na literatura há um limitante número de estudos científicos sobre esta e demais espécies de bambu. Os principais dados gerados são em espécies asiáticas, onde o uso dos bambus é mais intenso. No Brasil, ainda há pouco conhecimento a respeito da diversidade genética existente e das características populacionais dos bambuzais. Devido a este panorama, o objetivo deste estudo foi desenvolver marcadores microssatélites para a espécie G. chacoensis e utilizar os microssatélites desenvolvidos em populações nativas desta espécie. Amostras de folhas de plantas identificadas morfologicamente como G. chacoensis foram coletadas e realizada a extração de DNA total, utilizando o KIT Nucleo Spin Plant II (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). O DNA isolado de tecidos foliares foi sequenciado na plataforma Illumina MiSeq (San Diego, Estados Unidos das Américas). As sequências obtidas foram analisadas com o software CLC Genomics Worckbench® 8.0v. Para a identificação de locos microssatélites e desenho de iniciadores dos marcadores (forward | reverse) foram utilizados o software SSRLocator. Os marcadores selecionados foram validados para uso por meio da genotipagem de 168 indivíduos oriundos de oito populações distintas, sendo, seis destas, populações nativas da Mata Atlântica, coletadas no Parque Nacional do Iguaçu, Foz do Iguaçu, PR e duas populações cultivadas, uma em Florianópolis e outra em Rancho Queimado, SC, BR. Os marcadores com maior potencial de polimorfismo foram selecionados, sintetizados com fluorescência e utilizados para avaliar a diversidade genética nas populações nativas coletadas, totalizando 575 indivíduos coletados. Dentre os marcadores microssatélites obtidos, foram selecionados 35 pares (forward | reverse) para serem submetidos a testes de amplificação e otimização do protocolo de PCR. Destes, foram identificados 13 marcadores com maior potencial de uso. A validação dos marcadores para uso futuro foi realizada com indivíduos em seis populações distintas. Os 13 marcadores com maior potencial de polimorfismo foram selecionados e confeccionados com fluorescênciapara serem genotipados na plataforma ABI 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Estados Unidos das Américas). Dos 13 marcadores, sete (54%) detectaram polimorfismo, enquanto um não apresentou resultados satisfatórios de amplificação e foi descartado das análises seguintes. Os sete locos polimórficos encontrados são passiveis de serem empregados em estudos genéticos da espécie G. chacoensis. Com base na genotipagem das populações, foram verificados 25% de locos polimórficos, sendo Gcha 02 o loco com maior número de alelos (5). Alelos privados foram identificados no loco Gcha 02 para a população PF, no loco Gcha 05 para a população AF e dois alelos do loco Gcha 21 na população EF. A maior distância genética foi observada entre as populações IF e as demais, EF, AF e CF (0,150). As populações IF e PF apresentaram diferença genética menor entre si e maior distância genética quando comparadas as demais. A análise da estrutura populacional demonstra que a maior diversidade genética está entre os indivíduos, ao passo que as populações apresentaram elevada identidade genética. As populações de G. chacoensis presentes no Parque Nacional do Iguaçu apresentam reduzido polimorfismo nos locos microssatélites empregados neste estudo. Provavelmente devido à reduzida distância geográfica em que se encontram, bem como pela propagação vegetativa.Abstract : Since ancient times, bamboo (Poaceae: Bambusoidae) has been used by mankind. Historically, several Asian countries have intensively cultivated and exploited bamboo species, mainly as building material, utensils, food, among others. Brazil holds many indigenous species belonging to the subfamily Bambusoideae. Among them, Guadua chacoensis stands out by their morphological characteristics and hardiness. However, a limited number of scientific studies on bamboo species can be found in the literature. In general, these studies focus on Asian species, which have most intense use. In Brazil, little is known about the genetic diversity and population characteristics of bamboo groves. Thus, the objective of this study was to develop microsatellite markers for G. chacoensis and use these developed microsatellites in naturally occurring populations. Leaf samples of individuals morphologically identified as G. chacoensis were collected for DNA extraction using the Nucleo Spin Plant II Kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany). A single individual were arbitrarily chosen for sequencing in Illumina MiSeq platform (San Diego, United States of America). The obtained sequences were analyzed with CLC Genomics Worckbench® 8.0v software. Microsatellite identification and primer design (forward | reverse) were made on SSRLocator software. The selected markers were validated for use by genotyping 168 individuals from eight different populations: six naturally occurring populations of the Atlantic Florest, in the Iguaçu National Park, Foz do Iguaçu, PR; and two grown populations, one in Florianópolis and another in Rancho Queimado, SC, BR. Among the obtained microsatellite markers, 35 pairs were selected (forward | reverse) to undergo amplification testing and PCR optimization. The 13 markers with higher polymorphism potential were selected and fluorescence-dyed for genotyping in 3500xL ABI Genetic Analyzer platform (Applyed Biosystems, Foster City, United States of America). The validation of these markers was performed with individuals of six different populations, totaling 575 individuals collected. Seven markers (54%) were polymorphic, five were monomorphic, and one was discarded for not showing satisfactory results of amplification. The seven polymorphic loci found are likely to be used in genetic studies G. chacoensis species. Based on the population genotyping, 25% of loci were polymorphic, with Gcha 02 presenting the highest number of alleles (5). Private alleles were identified in loci Gcha 02 (PF population), Gcha 05 (AF population), and Gcha 21 (EF population). The largest genetic distance (0.150) wasobserved between IF population and the others (EF, AF, and CF). The IF and PF populations had lower genetic difference between them and greater genetic distance when compared with others. The population structure analysis shows that greater genetic diversity is among individuals, while populations showed high genetic identity. Populations of G. chacoensis in the Iguaçu National Park have reduced polymorphism in microsatellite loci used in this study, probably due to the limited geographical distance between them and the vegetative propagation characteristic of the species