Padronização da técnica de cultura organotípica de hipocampo de rato para avaliação do efeito neuroprotetor da lectina Canavalia brasileiensis (ConBr) em um modelo in vitro de isquemia cerebral

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016.Lectinas são proteínas que se ligam a carboidratos presentes em glicoconjugados podendo regular diversas funções celulares em eventos fisiológicos e patológicos. ConBr é uma lectina isolada das sementes de Canavalia brasiliensis e possui alta afinidade por glicose/manose. Trabalhos anteriores do nosso grupo demonstraram que ConBr apresenta efeito neuroprotetor em relação às convulsões induzidas por ácido quinolínico e à excitotoxicidade glutamatérgica em fatias de hipocampo por mecanismos que podem envolver inibição de receptores NMDA e a modulção da via PI3K/Akt. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade no mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos que desencadeiam morte neuronal e de estratégias de neuroproteção. Culturas organotípicas hipocampais (COH) submetidas à privação de oxigênio e glicose representam um modelo in vitro de isquemia cerebral e têm sido utilizadas para compreender as alterações neuroquímicas e celulares nesse processo bem como para pesquisar possíveis agentes neuroprotetores. O objetivo desse estudo foi padronizar, para as condições locais, a técnica de cultura organotípica hipocampal (COH) e investigar o potencial neuroprotetor de ConBr sobre essas culturas submetidas à privação de oxigênio e glicose e reperfusão (POG/Rep). Nossos resultados demonstram que o tratamento com ConBr (1 µg/mL) diminuiu significativamente a morte celular induzida por POG na região CA1 do hipocampo. Através das análises de imunohistoquímica, podemos observar alterações na morfologia dos astrócitos com escassez de ramificações no grupo POG. O tratamento com ConBr promoveu significativa melhora da viabilidade celular sendo capaz de manter a densidade e morfologia dos astrócitos positivos para GFAP semelhantes ao grupo controle. Além disso, POG induziu uma diminuição de células positivas para NeuN e o tratamento com ConBr foi capaz de reverter esse processo. Embora mais estudos sejam necessários para avaliar os mecanismos de neuroproteção de ConBr frente ao dano isquêmico, os resultados obtidos neste estudo indicam o potencial de lectinas de plantas como estratégia para neuroproteção.Abstract : Lectins are carbohydrate-binding proteins that can recognize glycoconjugates, regulating many cell functions in physiological and pathological events. ConBr is a lectin isolated from Canavalia brasiliensis seeds that displays high affinity for mannose/glucose. Previous work by our group demonstrated that ConBr displays neuroprotective effect against seizures induced by quinolinic acid and glutamatergic excitotoxicity in hippocampal slices, through a mechanism involving NMDA inhibition and modulation of PI3K/Akt. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality in the world, which makes this pathology target of many studies to understand the mechanisms that trigger neuronal deathand to search strategies for neuroprotection. Organotypic hippocampal cultures (OHCs) subjected to oxygen and glucose deprivation has been applied as in vitro model to study the neurochemical and cellular alterations in the cerebral ischemia, as well as to search compounds with neuroprotective activity. The aim of this study was to adapt the technic of organotypic hippocampal cultures (OHC) for our local conditions and investigate the neuroprotective potential of ConBr on these cultures subjected to oxygen and glucose deprivation and reperfusion (OGD/Rep). Our results demonstrate that treatment with ConBr (1µg/mL) significantly decrease OGD-induced cell death in CA1 region of the hippocampus. Through immunohistochemical analysis, we can observe changes in the morphology of astrocytes with scarcie ramifications in the OGD group. Treatment with ConBr promoted significant improvement in cell viability being able to maintain the density and morphology of the GFAP-positive astrocytes similar to the control group. In addition, we observed a decrease of NeuN-positive cells in the OGD group and treatment with ConBr was able to improve neuronal survival. Although further studies will be necessary to evaluate the neuroprotective mechanisms induced by ConBr against ischemic damage, the results obtained in the present study suggest the potential of plant lectins as a strategy for neuroprotection