Alcoholysis reaction study of biodiesel synthesis by recombinant Rhizopus oryzae lipase

L'escalfament global i la contaminació medioambiental han promogut la recerca científica i polítiques governamentals per tal de desenvolupar i aplicar processos de producció més sostenibles, un ús més racional de l'energia i la implenetació de sistemes de reciclatge. En aquest sentit, els alquil èsters d'àcids grassos - coneguts com a biodièsel - suposen una alterntaiva sostenible i renovable al dièsel convencional, i en l'actualitat ja s'usa mesclat amb dièsel. El biodièsel s'obté per transesterificació d'olis vegetals o grasses animals amb un alcohol - normalment metanol. Després de la seva combustió, el diòxid de carboni resultant és fixat per les plantes mitajançant la seva fotosíntesi, i convertit a biomassa a partir de la qual es torna a obtenir oli per fabricar-ne biodièsel. Així, l'avantatge principal del biodièsel respecte el dièsel convencional és que el seu ús és un cicle tancat de carboni, fet que evita l'augment del carboni ambiental, i a més a més no presenta els futurs problemes d'esgotament dels combustibles fòssils. En un altre ordre de coses, l'ús d'enzims s'ha estès dins la indústria, principalment perquè els processos enzimàtics són més sostenibles i tenen menys consum energètic que els processos convencionals. Malgrat tot, l'elevat preu dels enzims limita encara el seu ús i per tant és necessària més recerca. La utilització de lipases per generar biodièsel és un exemple de l'ús d'enzims per substituir mètodes convencionals. A la natura, les lipases es troben als éssers vius i la seva funció és la hidròlisi dels greixos - és a dir, triacilglicerols -, obtenint àcids grassos lliures. Recentment, l'ús de les lipases s'ha explorat com a alternativa a l'actual mètode d'obtenció de biodièsel, degut a que té un consum d'energia inferior i també perquè les lipases poden sintetitzar biodièsel a partir d'un rang de matèries primeres més ampli. Aquesta tesi s'ha focalitzat a l'estudi de la lipasa de Rhizopus oryzae, expressada recombinantment a partir de Pichia pastoris, com a biocatalitzador d'alquil èsters d'àcids grassos. En primer lloc es va estudiar la inactivació de la lipasa causada pel metanol, fet el qual és un dels principals inconvenients en l'ús de les lipases, així com també l'efecte de l'aigua en aquesta inactivació; d'aquest primer estudi, se'n va concloure que l'aigua contrarresta l'efecte negatiu del metanol, encara que la seva presència incrementa la hidròlisi dels greixos en lloc de la seva transesterificació. La presència d'àcids grassos lliures a les matèries primeres és un inconvenient important pels mètodes químics actuals d'obtenció de biodièsel, mentre que les lipases poden dur a terme sense problemes la transesterificació amb presència d'àcids lliures, convertint-los també a biodièsel. Així, la segona part de la tesi va ser centrada en estudiar si aquests àcids grassos lliures poden tenir algun efecte sobre les lipases, concloent que no només no perjudiquen l'enzim, sinó que la seva presència redeix l'efecte negatiu del metanol. Degut a la varietat de components implicats a la transesterificació enzimàtica - tri-, di-, monoacilglicerols, àcids grassos lliures, alcohol, aigua i biodièsel -, es varen realitzar experiments per determinar el mecanisme de reacció de la transesterificació. Es va concloure, que el biodièsel s'obté enzimàticament per combinació de l'alcohòlisi directa dels greixos i l'hidròlisi dels greixos i la posterior esterificació dels àcids grassos alliberats. També és va determinar que la lipasa de Rhizopus oryzae no necessita l'activació interfacial, fenomen característic de les lipases. Finalment, es va fer un estudi comparatiu de l'especificitat de la lipasa respecte acilglicerols i alcohols, demostrant que l'enzim és molt més específic per 1-monooleïna que per trioleïna, i presenta més tolerància a l'etanol que el metanol.Global warming and environmental pollution have fostered scientific research and encouraged governmental policies to develop and implement greener production processes, a more rational energy usage and recycling life cycles. In that sense, fatty acid alkyl esters - commonly known as biodiesel - have emerged as a green and renewable alternative to conventional diesel and currently it is commercially used in blends with diesel. Biodiesel is obtained by transesterification of vegetable oils or animal fats with an alcohol - most often methanol. After its combustion, carbon dioxide is fixed and converted to new biomass by photosynthesis, from which biodiesel is again produced. Thus, the main advantage of biodiesel over diesel is that its production and utilisation is a closed carbon cycle, which does not contribute to increasing atmospheric carbon levels, and overcomes the future depletion of fossil fuels. Moreover, the employment of enzymes has become widespread within the industrial sector, especially because enzymatic procedures are greener and have less energy demand compared to traditional chemical ones. However, the high price of enzymes still limits their utilisation and further scientific research is needed. The use of lipases to produce biodiesel constitutes one example of the employment of enzymes to replace an existing chemical production process. In nature, lipases are found in living organisms, which use them to catalyse the hydrolysis of triacylglycerols - i.e. lipids -, obtaining free fatty acids after breaking ester bonds. In recent years, their employment in the synthesis of biodiesel has been explored as a suitable alternative to the present chemical catalysis processes, due to its lower energy consumption and also because lipases can produce biodiesel from a larger variety of initial raw materials, compared to conventional process. This dissertation has been focused on the study of the Rhizopus oryzae lipase, expressed recombinantly by Pichia pastoris, as biocatalyst to synthesise fatty acid alkyl esters - Rhizopus oryzae lipase and recombinant Rhizopus oryzae lipase are referred to in the present booklet as ROL and rROL, respectively. Initially, methanol inactivation of the lipase, which remains the main drawback for the employment of lipases in biodiesel production, and the effect of water on this inactivation were investigated, concluding that water can buffer methanol's negative effect on lipase, although it increases the hydrolysis of triacylglycerols. The presence of free fatty acids in the initial raw material is a major obstacle in conventional chemical biodiesel production, whereas lipases can handle perfectly free fatty acids, esterifying them to biodiesel. Thus, in the second part of the thesis the effect of free fatty acids on the lipase was also studied, concluding that not only do they not represent a problem for enzymatic biodiesel production, but also their presence reduces lipase inactivation by methanol. Due to the variety of compounds present throughout the lipase catalysis - tri-, di-, monoacylglycerols, free fatty acids, alcohol, water and biodiesel -, experiments to elucidate the whole transesterification reaction pathway were carried out. It was found that biodiesel was obtained by a combination of reactions, namely, direct triacylglycerol alcoholysis, triacylglycerol hydrolysis and free fatty acids esterification. It was also determined that rROL does not need the so-called interfacial activation, widely attributed to lipases. Finally, a comparative study of alcohol type and lipase specificity towards acylglycerols was also performed, demonstrating that rROL exhibits better tolerance to ethanol compared to methanol, and higher specificity towards 1-monoolein than triolein