Clonaje posicional y validación de un gen candidato para eth6.3, un QTL implicado en la maduración climatérica del fruto del melón

La maduración del fruto es un proceso metabólico y fisiológico complejo, está altamente regulado e influye directamente sobre la calidad organoléptica y su valor económico. Un compuesto importante es el etileno, y en función de su patrón de síntesis los frutos pueden ser divididos en climatéricos y no climatéricos. En los frutos climatéricos ésta hormona vegetal coordina y acelera el proceso de maduración a través de la regulación a nivel transcripcional y traduccional de varios genes. Las rutas de regulación génica tanto dependientes como independientes de etileno coordinan el proceso en ambos tipos de maduración, aunque se conoce mucho menos sobre la maduración no climatérica. La existencia de variedades de melón con ambos tipos de maduración y el avanzado desarrollo de herramientas genéticas y genómicas convierten a esta especie en un buen modelo para el estudio de la maduración del fruto. El QTL eth6.3, objeto de estudio de esta tesis doctoral, fue detectado junto con eth3.5 durante la caracterización de la línea casi isogénica SC3 5 1 (portadora de los dos QTLs), obtenida a partir del cruzamiento entre "Piel de Sapo" (PS) y "Songwhan Charmi" (SC). Ambos QTLs son capaces de inducir una maduración climatérica por separado, pero cuando están juntos interaccionan produciendo un fenotipo climatérico más fuerte. En este trabajo se ha realizado el clonaje posicional de eth6.3 a través del desarrollo de una población de mapeo obtenida a partir de un individuo con alelos de PS en homocigosis para eth3.5 y segregante para eth6.3. El análisis fenotípico de 15 recombinantes en el intervalo del QTL permitió identificar el gen MELO3C016540, miembro de la familia de factores de transcripción tipo NAC en melón, como responsable de eth6.3. Para su validación se buscaron mutantes en una colección de TILLING con fondo climatérico, encontrándose dos familias con mutaciones dentro del dominio NAC que mostraron un retraso en el proceso de maduración respecto a frutos no mutados. El análisis de MELO3C016540 en un panel con 54 variedades de melón, representativas de la variabilidad existente dentro de la especie, reveló una alta conservación en los haplotipos de este gen entre variedades con el mismo tipo de maduración que sugiere un papel central en la regulación de este proceso. Finalmente, también se inició una nueva aproximación para la caracterización de MELO3C016540 mediante el desarrollo de construcciones genéticas para su silenciamiento mediante RNAi en líneas portadoras de eth6.3. De forma complementaria, en la última parte de este trabajo de tesis se ha realizado un estudio transcriptómico del fruto de la línea SC3 5 1 y PS a lo largo de la maduración, observándose una reprogramación genética global entre frutos maduros de las dos líneas. Se encontró expresión diferencial de algunos genes implicados en procesos de maduración climatérica como la biosíntesis y señalización de etileno, el reblandecimiento de la pared celular y la biosíntesis de compuestos aromáticos, así como genes pertenecientes a las familias de factores de transcripción NAC, MADS box, F box y HD zip. En conjunto, este trabajo ha permitido profundizar en el estudio de la regulación de la maduración en melón y comenzar a entender las diferencias entre frutos climatéricos y no climatéricos de esta especie.Fruit ripening is a complex and highly regulated metabolic and physiological process that has a great influence in the organoleptic quality and economical value of the fruit. Ethylene is the main plant hormone involved in ripening regulation and, depending on its expression pattern, fruits can be classified as climacteric and non-climacteric. In climateric fruits, ethylene coordinates and accelerates ripening through gene regulation at the transcriptional and traslational level. Ethylene-dependent and independent regulation pathways coordinate both kinds of ripening, but much less is known about non-climacteric ripening. The existence of both climacteric and non-climacteric genotypes and the advances in the development of genetic and genomic tools make melon a suitable model for fruit ripening studies. The aim of this doctoral thesis in the study of QTL eth6.3, which was detected along with eth3.5 during the characterization of near isogenic line SC3-5-1 (that harbors both QTLs), obtained from a cross between "Piel de Sapo" (PS) and "Songwhan Charmi" (SC). Both QTLs can induce climacteric ripening on their own, but together they interact producing a stronger climacteric phenotype. This work presents the positional cloning of eth6.3 through the development of a mapping population obtained from an individual with PS homozygous alleles in eth3.5 and segregant in eth6.3. Phenotypic analysis of 15 recombinant lines in the QTL interval allowed the identification of MELO3C016540, a NAC domain transcription factor, as responsible of eth6.3. For validation, a TILLING collection in a climacteric background was screened for mutants. Two families with mutations in the well-conserved NAC-domain showed a delay in ripening when compared with wild-type individuals. The analysis of MELO3C016540 in a collection of 54 melon varieties representing the existing variability within the species revealed that the haplotypes within this gene are highly conserved among varieties that show the same kind of ripening, suggesting a central role in its regulation. Finally, a new approach for the characterization of MELO3C016540 was started by the development of genetic constructions for gene silencing mediated by RNAi in lines harboring eth6.3. Complementarily, a fruit transcriptome study of lines SC3-5-1 and PS during ripening was performed, revealing a global genetic reprogramming between ripe fruits from both lines. Genes involved in climacteric ripening processes like ethylene biosynthesis and signaling, fruit softening, aroma biosynthesis, and transcription factor families NAC, MADS-box, F-box and HD-zip were differentially expressed. In conclusion, this work has contributed to increase the knowledge of melon ripening regulation and to start uncovering the differences between climacteric and non-climacteric fruit ripening