Functional and structural analyses of the terminal organelle of Mycoplasma genitalium

Mycoplamsa genitalium es un patógeno humano causante de uretritis no gonocócica y no causada por clamidias en hombres y de enfermedad pélvica inflamatoria y cervicitis. Los micoplasmas, además de ser muy interesantes para el estudio como células mínimas (dado el pequeño tamaño de su genoma), también presentan características únicas sólo presentes en este género. En particular, se ha detectado la presencia de mecanismos de adhesión y de motilidad, que además de estar implicados en el mecanismo de infección, sólo se encuentran en este género. En especial, el mecanismo de motilidad de M. genitalium consta de una estructura polar que contiene un característico citoesqueleto. Se conoce que este citoesqueleto está formado por varias proteínas implicadas en el proceso de adhesión y motilidad. En los tres primeros capítulos de esta tesis se ha determinado el papel de tres de estas proteínas: MG219, MG318 (también llamada P32) y MG386. El estudio se ha realizado gracias a la obtención de mutantes defectivos de estas proteínas. La proteína MG219 se ha hallado que es necesaria para el correcto funcionamiento de la maquinaria de motilidad de este organismo. Mediante fusión a proteínas fluorescentes se ha determinado la localización subcelular de esta proteína, que resulta localizar en la parte más cercana de la organela terminal respecto al cuerpo celular. Las células en ausencia de MG219 se mueven a una velocidad inferior a la mitad (y la mitad de frecuentemente) que las células de la cepa salvaje. Esta reducción de la velocidad es concomitante con la aparición de un mayor número de células en división y con múltiples organelas terminales. De una manera similar, las células de la cepa que carece la proteína P32 se mueven a velocidades inferiores (y con la mitad de frecuencia) que las células de la cepa salvaje. Además, se ha determinado que el N-terminal de P32 juega un papel importante en la estabilidad de las proteínas P110 y P140, las más importantes adhesinas de M. genitalium. También se ha establecido que la proteína P32 es crítica para la morfología de la parte más distal de la organela terminal. El último mutante generado en este trabajo, el defectivo para la proteína MG386, presenta importantes variaciones tanto a nivel de morfología celular como de motilidad. Las células de esta cepa presentan motilidad la mitad de frecuentemente que la cepa salvaje pero se mueven a una velocidad 1.7 veces superior. Sorprendentemente, esta cepa presenta un gran número de organelas terminales desancladas del cuerpo celular, sugiriendo un importantísimo papel de la proteína MG386 en el anclaje de la organela terminal al cuerpo celular. Se ha observado que la membrana alrededor del citoesqueleto se encuentra completamente recubierta por el complejo de adhesión o 'nap'. Mediante estudios de microscopia electrónica se ha determinado la estructura a 3.5 nm por ctomografia crioelectrónica y a 1.9 nm por tinción negativa. Además, la tomografía crioelectrónica también ha desvelado la estructura a baja resolución del botón terminal del citoesqueleto, revelando que las placas que forman la mayor parte del citoesquelto son, en realidad, anillos de unos 20 nm de diámetro. Además, se han analizado por tomografía crioelectrónica 14 mutantes que carecen de diferentes proteínas (o dominios de éstas) relacionadas con motilidad y/o adhesión. El conjunto de todos estos datos aporta una visión global al conocimiento previo (y al generado en este trabajo) sobre el papel de las proteínas implicadas motilidad y formación del citoesqueleto de M. geniatliumMycoplamsa genitalium is a human pathogen and the causative agent of non-gonococcal non-chlamydial urethritis in men and pelvic inflammatory disease and cervicitis. Mycoplasmas, besides being interesting as minimal cells (given the small size of its genome), also have unique features only present in its genus. In particular, the presence of mechanisms of adhesion and motility has been detected, and in addition of being involved in addition of being involved in the infection mechanism, are only found in this genus. In particular, the mechanism of motility of M. genitalium involves a polar structure containing characteristic cytoskeleton. It is known that the cytoskeleton is composed of several proteins involved in the adhesion and motility processes. In the first three chapters of this thesis dissertation the role of three of this proteins-MG219, MG318 (also called P32) and MG386-has been stablished. The study was conducted by obtaining null mutants strains of these proteins. The MG219 protein has been found to be necessary for the proper functionality of the motility machinery. By fusion to fluorescent proteins it has been determined the subcellular localization of this MG219, which located at the nearest part of the terminal organelle relative to the cell body. Cells in the absence of MG219 move slower than half speedy (and half frequently) the cells of the wild type strain. This speed reduction is concomitant with the appearance of a greater number of dividing cells and cell with multiple terminal organelles. In a similar manner, cells of the strain lacking P32 move at lower speeds (and with half also half frequently) than cells of the wild type strain. Furthermore, it has been determined that the N-terminal P32 plays an important role in protein stability P110 and P140, the major adhesins of M. genitalium. It has also been established that the P32 protein is critical to the morphology of the most distal part of the terminal organelle relative to the cell body. The last mutant generated in this work, the null mutant for MG386, presents significant alterations in both cell morphology and motility. The cells of this strain show motility half frequently than the wild type strain but move to a velocities as greater as1.7 times than the reference strain. Surprisingly, this strain has a high number of terminal organelles detached from the cell body, suggesting an important role of protein MG386 anchoring the organelle to the cell body. It has been observed that the membrane around the cytoskeleton is completely covered by the adhesion complex or "nap". By electron microscopy studies it has determined the structure by cryo-electron tomography at 3.5 nm and at 1.9 nm single particle by negative staining TEM of the purified P110 and P140 complex. Additionally, cryo-electron tomography also allowed to determine at low resolution the structure of the terminal button of the cytoskeleton, revealing that the plates forming most of the cytoskeleton are actually rings about 20 nm in diameter. In addition, 14 mutants lacking different proteins (or domains thereof) related to motility and / or adhesion have been analysed by cryo-electron tomography. All these data taken together provides an overview of the prior knowledge-in addition to the data generated in this work-of the role of the proteins involved motility and cytoskeleton formation in M. geniatlium