Estudi in vitro del paper del dany oxidatiu com a mecanisme d'acció en la carcinogènesi associada a l'arsènic

Premi Extraordinari de Doctorat concedit pels programes de doctorat de la UAB per curs acadèmic 2017-2018L'arsènic inorgànic es presenta com un carcinogen molt ben establert en humans. Milions de persones es troben exposades arreu del món, fonamentalment a través de l'aigua de consum contaminada per aquest compost. Encara que existeixen múltiples mecanismes d'acció pels quals l'arsènic pot exercir els seus efectes carcinògens, la generació de dany oxidatiu en el DNA a partir de les espècies reactives d'oxigen derivades de la seva biotransformació es presenta com un dels mecanismes importants a l'hora d'explicar l'aparició dels fenòmens tumorals associats amb la seva exposició. En aquest context, l'objectiu principal d'aquesta Tesi ha estat demostrar la connexió existent entre la presència de dany oxidatiu i la carcinogènesi associada a una exposició amb arsènic inorgànic. Per arribar a aquest objectiu s'ha implementat una estratègia innovadora de treball en el qual s'emulen les condicions d'exposició ambiental a les que es troben exposades les poblacions humanes. Concretament, aquesta estratègia es basa a desenvolupar un model d'exposició crònica in vitro a dosis subtòxiques d'arsènic inorgànic. A més, s'ha utilitzat un model cel·lular particular constituït per dues línies cel·lulars isogèniques de fibroblasts embrionaris de ratolí (MEF), una de les quals és deficient en la reparació de lesions oxidants del DNA que requereixen el mecanisme BER, exhibint un genotip knockout pel gen Ogg1, un dels gens principals de l'esmentada ruta de reparació del DNA. Al llarg d'aquest període d'exposició crònica a dosis de 0,5, 1 i 2 µM d'arsenit sòdic, es van avaluar diferents paràmetres en ambdues línies cel·lulars, els valors dels quals van ser comparats amb els corresponents controls temporals. Dits paràmetres mesuren els nivells acumulats de dany oxidatiu (8-OH-dG), la capacitat de reparar el dany en el DNA, l'estudi de possibles mecanismes d'adaptació i, finalment, l'adquisició d'un fenotip tumoral in vitro en ambdues línies cel·lulars al llarg d'un procés d'exposició arsenit sòdic del voltant 40 setmanes. Els resultats obtinguts donen suport a la hipòtesi reflectida en l'objectiu principal. Així, les línies cel·lulars Ogg1 deficients (MEF Ogg1 -/-) crònicament exposades a l'arsènic mostren una acumulació progressiva de dany oxidatiu en el DNA, mentre que l'increment d'aquest dany no es detecta en la línia salvatge. Paral·lelament, l'eficiència dels mecanismes de reparació del dany induït en el DNA es veu afectada en ambdues línies cel·lulars, manifestant-se així l'activitat cocarcinògena de l'arsènic. Pel que fa referència a l'adquisició del fenotip tumoral, trobem que l'arsènic és capaç d'induir un fenotip tumoral de manera primerenca en la línia deficient, el que indicaria que el dany oxidatiu en el DNA juga un paper fonamental en la carcinogènesi associada a l'exposició. Així, les cèl·lules Ogg1 -/- manifesten un fenotip tumoral al cap de 30 setmanes d'exposició, caracteritzat per canvis morfològics, un increment en proliferació cel·lular, el descontrol en estat de diferenciació, l' increment en la secreció de metal·loproteïnases de la matriu extracel·lular, l'adquisició de la capacitat de créixer independent d'ancoratge, i la capacitat de promoure el creixement tumoral i la invasió. A manera de conclusió, aquesta Tesi demostra, principalment i per primera vegada, que el fons genètic referent al gen OGG1 i la inducció de 8-OH-dG són factors rellevant en el procés de carcinogènesi associada a l'arsènic. Indirectament, el treball posa de manifest el risc associat dels individus amb polimorfismes al gen OGG1, fent-los més susceptibles a l'aparició dels efectes genotòxics i carcinògens derivats de l'exposició.Inorganic arsenic is presented as a very well established human carcinogen. Millions of people around the world are exposed to this compound mainly through contaminated drinking water. Although there are multiple mechanisms of action by which arsenic may exercise their carcinogenic effects, the generation of oxidative DNA damage from reactive oxygen species derived from its biotransformation is presented as one of the most important mechanisms explaining the associated cancer phenomena. In this context, the main objective of this thesis was to demonstrate the connection between the presence of oxidative damage and carcinogenesis, linked to inorganic arsenic exposure. In order to reach this objective, we have implemented an innovative strategy plan which emulated environmental conditions in which human populations are exposed. Specifically, this strategy is based on developing an in vitro model of chronic exposure to subtoxic inorganic arsenic doses. In addition, we used a particular cell model comprising two isogenic cell lines from mouse embryonic fibroblasts (MEF), being one of them deficient in the repair of oxidative DNA lesions that require the BER mechanism, showing a knockout genotype for Ogg1, one of the major genes of this DNA repair pathway. Throughout this period, cells were exposed to 0.5, 1 and 2 µM of sodium arsenite for 40 weeks. Different parameters were evaluated in both cell lines, the values of which were compared with the corresponding time-matched controls. These parameters were the accumulated levels of oxidative damage (8-OH-dG), the ability of repairing DNA damage, the mechanisms of adaptation and, finally, the acquisition of an in vitro tumor phenotype. Results supported the main hypothesis. Thus, Ogg1 deficient cell lines chronically exposed to arsenic showed a progressive accumulation of oxidative DNA damage, whereas that increase was not detected in its wildtype counterparts. Moreover, the efficiency of DNA repair mechanisms in repairing the induced damage was affected in both cell lines, manifesting the arsenic co-carcinogen activity. Taking into account the acquisition of the tumor phenotype, we found that arsenic can induce an early tumor phenotype in the deficient Ogg1 cell line, indicating that oxidative DNA damage plays a role in carcinogenesis associated with the exposure. Thus, Ogg1 - /- cells expressed a tumor phenotype after 30 weeks of exposure, characterized by morphological changes, an increase in cell proliferation, the lack of a correct differentiation status, the increase in secretion of extracellular matrix metalloproteinases, the acquirsition of the ability to grow independent of anchor, and the acquisition of the ability to promote tumor growth and invasion. In conclusion, this thesis shows for the first time that the genetic background of the reference gene OGG1 and the induction of 8-OH-dG are key factors in the arsenic-associated carcinogenesis. Indirectly, the work highlights the associated risk of individuals carrying OGG1 gene polymorphisms, as they are expected to be more susceptible to the genotoxic and carcinogenic effects of the exposure