Aplicación de la microdiálisis en la definición del perfil iónico del edema cerebral postraumático e isquémico : estudio de la contribución del canal SUR1-TRPM4 en su formación /

Premi Extraordinari de Doctorat concedit pels programes de doctorat de la UAB per curs acadèmic 2017-2018Los traumatismos craneoenfálicos (TCE) y los infartos malignos de la arteria cerebral media (IMACM) provocan importantes desequilibrios iónicos, generando una entrada masiva de iones en las células, con el consecuente arrastre osmótico de agua y la formación de edema cerebral. La alteración de las concentraciones iónicas induce la acumulación de agua en el espacio intra y extracelular (EEC), causando hinchazón del tejido cerebral lesionado y deterioro clínico de estos pacientes. Estos trastornos iónicos están directamente relacionados con la sobreexpresión de distintos canales iónicos, constitutivos o de nueva expresión como el canal formado por el receptor de la sulfonilurea 1 (SUR1) y el receptor de potencial transitorio de la melastatina 4 (TRPM4) conocido como SUR1-TRPM4. Las técnicas actuales de neuromonitorización permiten el estudio de los procesos que tienen lugar tras una lesión cerebral aguda. Entre ellos, la microdiálisis (MD) cerebral es una técnica de neuromonitorización avanzada que permite el muestreo continuo del EEC. Los objetivos principales de esta tesis fueron: 1) estudiar la expresión del SUR1 en distintos tipos celulares (neuronas, células endoteliales, astrocitos, microglía reactiva/macrófagos y neutrófilos) en el tejido cerebral pericontusional determinado, además, si su grado de expresión estaba relacionado con el tiempo postraumatismo, 2) determinar la recuperación relativa (RR) in vitro de Na+, K+, Cl-, albúmina y cistatina C con membranas de MD de 100 kDa (CMA71) a una velocidad de perfusión de 0,30 µL/min, 3) estimar el perfil iónico y molecular del EEC cerebral en las distintas áreas cerebrales en las que se insertó el catéter de MD en pacientes con lesiones cerebrales agudas y 4) definir la aparición de edema vasogénico a partir de la detección de albúmina y cistatina C en el EEC del encéfalo. En primer lugar, para el estudio de la expresión del SUR1 en el tejido pericontusional, se analizó un grupo de 26 muestras de contusiones cerebrales de pacientes tratados quirúrgicamente y 3 controles de tejido cerebral normal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia. Los resultados objetivaron que el SUR1 se sobreexpresaba en todos los tipos celulares cerebrales estudiados. Sin embargo, el patrón temporal de expresión del SUR1 era distinto para cada tipo celular. En segundo lugar, para el cálculo de la RR de iones se llevaron a cabo 9 experimentos in vitro con catéteres de MD CMA-71 aplicando las condiciones estándar utilizadas en un entorno clínico, determinándose las concentraciones iónicas, tanto en el dializado y como de la matriz. Un modelo de regresión lineal permitió calcular las concentraciones iónicas reales en la matriz. Por último, para el análisis de perfil iónico del EEC cerebral se analizaron los microdializados de 34 pacientes con un TCE o IMACM que recibieron monitorización multimodal durante las primeras 48 horas tras el TCE o del inicio de los síntomas del IMACM. Se determinó la concentración iónica en 12 muestras por paciente mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, considerando que el perfil iónico de los pacientes depende de la zona de inserción del catéter de MD. Los resultados mostraron que los niveles de K+ en el EEC guardan relación con la viabilidad del tejido, mientras que los Na+ con la permeabilidad de barrera hematoencefálica. La MD ofrece la posibilidad única de observar las transformaciones dinámicas de los iones en el cerebro a través del tiempo y abre una nueva vía para explorar el perfil iónico del cerebro, sus cambios en el edema cerebral y cómo este perfil se puede modificar con diferentes terapias. Definir el perfil molecular del edema puede servir como índice cuantitativo de progresión del edema, permitiendo la modulación farmacológica de sus distintas etapas y potenciales tratamientos dirigidos al bloqueo selectivo de SUR1Traumatic brain injury (TBI) and malignant middle cerebral artery infarction (MMCAI) cause significant ionic imbalances, generating massive ionic fluxes with the consequent osmotic water movement across the cells and the cerebral edema formation. Changes in ionic concentrations induce water accumulation in the intracellular and extracellular space and cause swelling of the injured brain tissue and neurological worsening in patients. These ionic disorders are directly related to the overexpression of different ion channels, that can be constitutive or newly synthesized as the channel formed by the sulfonylurea receptor 1 (SUR1) and transient receptor potential of melastatin 4 (TRPM4) known as SUR1-TRPM4. Current neuromonitorization techniques allow the study of the processes occurring after acute brain injury. Cerebral microdialysis (MD) is an advanced neuromonitorization technique that allows continuous sampling of the cerebral parenchyma. The main objectives of this thesis were: 1) to study SUR1 expression in different cell types (neurons, endothelial cells, astrocytes, reactive microglia/macrophages and neutrophils) in pericontusional brain tissue and whether SUR1 up-regulation was related to time post injury, 2) to calculate the in vitro relative recovery (RR) of Na+, K+, Cl-, albumin and cystatin C with membranes of 100 kDa MD (CMA71) at an infusion rate of 0.30 µL/min, 3) to determine the ionic and molecular profile of brain extracellular space in different brain areas in which MD catheter was inserted in patients with acute brain injury and 4) to define the development of vasogenic edema by the albumin and cystatin C detection in the brain extracellular space. First, to study SUR1 expression in pericontusional tissue, 26 samples obtained from brain-injured patients who underwent surgical treatment and 3 normal brain tissue samples as a control were analyzed using inmunofluorescence. The results showed that SUR1 is overexpressed in all studied cell types. However, the temporal pattern of SUR1 expression was found to be different in each cell type. Secondly, to calculate the RR of ions, 9 experiments were performed in vitro with MD CMA-71 catheters under standard conditions for clinical settings. Ionic concentrations were determined in both the dialysate and the matrix. A linear regression model was used to calculate the true ionic concentrations in the matrix. Finally, to analyze the ionic profile of brain extracellular space, microdialysate samples of 34 patients were analyzed. The patient group had presented with moderate or severe TBI or MMCAI, and received multimodal monitoring during the first 48 hours after injury or start of symptoms. Ionic concentrations were determined in 12 samples for each patient using inductively coupled plasma mass spectrometry. Ionic profile was studied according to where the MD catheter was inserted. The results showed that K+ levels in the extracellular space were related to tissue viability, while the Na+ concentration was related to blood-brain barrier permeability. MD offers a unique opportunity to observe the dynamic transformations of ions in the brain over time and opens up a new path to explore the ionic profile of the brain in terms of how it changes during brain edema and how it may be modified through different therapies. A definition of the molecular profile in brain edema can be used as a quantitative index of edema progression, which may allow different stages to be managed pharmacologically and potential treatments directed at selectively blocking SUR1 to be developed