Haemophilus parasuis host-pathogen interactions in the respiratory tract

En el sector veterinario, la enfermedad de Glässer es un proceso patogénico frecuente que conduce a pérdidas económicas considerables. Esta enfermedad es causada por Haemophilus parasuis. Aunque se ha llevado a cabo un esfuerzo importante hacia la comprensión de los factores que intervienen en la evolución de la enfermedad, la falta de completa protección de las vacunas comerciales sugieren que debe dirigirse más trabajo hacia el estudio de este proceso patogénico. Para aumentar el conocimiento en patogénesis desarrollamos una serie de experimentos. Es bien sabido que existen diferentes cepas de H. parasuis, desde no virulentas a altamente virulentas. Ciertos mecanismos patogénicos se atribuyen a la virulencia de algunas cepas, mientras que las cepas no virulentas solamente colonizan el tracto respiratorio superior y no son capaces de causar enfermedad. Estos diferentes grados de virulencia podrían ser apreciados durante los primeros pasos de la infección. De este modo, usando muestras de las vías respiratorias de lechones infectados con dos cepas virulentas (Nagasaki y IT29755) y dos cepas no virulentas (SW114 y F9), se desarrollaron métodos de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, así como una doble tinción de H. parasuis y macrófagos/neutrófilos. Nuestros resultados revelaron que las cepas virulentas de H. parasuis estaban presentes en cornete nasal, tráquea y pulmón. Detalles adicionales mostraron que las cepas virulentas de H. parasuis no solo se asociaron a macrófagos y neutrófilos del pulmón, sino también a células tipo neumocitos. Por lo tanto, las cepas virulentas de H. parasuis fueron capaces de adherirse al epitelio de las vías respiratorias, invadir y diseminarse en el huésped. Por el contrario, las cepas no virulentas apenas se detectan en el tracto respiratorio. La cepa virulenta Nagasaki mostró patrones de biofilm en tráquea, que nos hizo cuestionar el papel de la formación de biofilm en la infección. Dado que la literatura publicada anteriormente indicaba que la formación de biofilm se presentaba principalmente en cepas no virulentas, se realizó una investigación adicional en esta dirección para comparar la formación de biofilm en cepas virulentas y no virulentas de H. parasuis. Nuestros resultados confirmaron que la capacidad de formar biofilm in vitro se presenta principalmente en cepas no virulentas. Por tanto, se secuenció el transcriptoma de la cepa no virulenta F9 durante su crecimiento en biofilm utilizando un modelo in vitro. Los resultados sugieren que bajo condiciones de biofilm, H. parasuis muestra un metabolismo reducido, demostrado por el perfil de expresión génica. Además, algunos de los genes inducidos en condiciones de biofilm eran específicos de las cepas no virulentas, como la hemaglutinina filamentosa fhaB, previamente asociada a la formación de biofilm en otras bacterias. Finalmente, la observación de cepas virulentas de H. parasuis en pulmón durante la infección motivó la secuenciación del transcriptoma de una cepa patógena en esta ubicación. Se determinó la expresión génica después de una infección corta in vivo y tras la inoculación de pulmón ex vivo. Los resultados mostraron tendencias comunes en la expresión génica de H. parasuis bajo infección pulmonar in vivo y ex vivo, como la reducción del metabolismo y la expresión de genes implicados en la adquisición de nutrientes, lo que podría indicar una estrategia de supervivencia en estas condiciones. Durante la infección pulmonar también se detectaron genes únicos de cepas virulentas de H. parasuis que codifican para proteínas de membrana externa. Estos genes requerirán una mayor caracterización como factores de virulencia, pudiendo ser también útiles para desarrollar nuevos antibióticos y vacunas. Nuestros resultados también apoyan el uso de explantes de pulmón como modelo para estudios de patogenicidad de otras bacterias respiratorias.In the veterinary field, Glässer's disease is a common pathogenic process that leads to considerable economic losses. This disease is caused by Haemophilus parasuis. Although considerable effort has been focused towards understanding the factors involved in disease outcome, evidences of lack of complete protection of commercial vaccine formulations suggest that more work should be addressed towards understanding this pathogenic process. To fill this gap in pathogenesis knowledge we developed a series of experiments. It is well known that different H. parasuis strains exist, ranging from non-virulent to highly virulent. Particular pathogenic mechanisms are attributed to virulence strains, while non-virulent strains only colonize the upper respiratory tract and are unable to cause disease. It is expected that these different virulence degrees can be appreciated also during the early steps of infection. Using samples from the respiratory tract of piglets infected with two virulent strains (Nagasaki and IT29755) and two non-virulent strains (SW114 and F9), immunohistochemistry and immunofluorescence methods were developed, as well as a double staining targeting H. parasuis and macrophage/neutrophil cells. Our results revealed that H. parasuis virulent strains were present in nasal, trachea and lung locations. Additional details showed that virulent H. parasuis was associated to macrophages and neutrophils in lung, but also to pneumocyte-like cells. Thus, virulent H. parasuis was able to attach to respiratory tract epithelia, invade and disseminate into the host. On the contrary, non-virulent strains were barely detected in the respiratory tract. Biofilm-like patterns were displayed by virulent Nagasaki strain in trachea and this made us question the role of biofilm formation in infection. Since previously published reports indicated that biofilm formation was mainly present in non-virulent strains, we performed additional research in this direction to compare biofilm formation with virulent and non-virulent H. parasuis strains. Our results confirmed that the capacity to form biofilm in vitro was mainly presented by non-virulent strains. Thus, we sequenced the transcriptome of non-virulent F9 strain under biofilm growth using an in vitro model. Results suggested that under biofilm conditions H. parasuis showed a low metabolic state, as indicated by the gene expression profile. Some of the genes induced under biofilm conditions were specific of non-virulent strains, as the filamentous hemagglutinin fhaB, which has been associated to biofilm formation in other bacteria. Additionally, the observation of virulent H. parasuis strains in the lung during infection inspired us to sequence the transcriptome of a pathogenic strain in this location. Gene expression was determined after a short in vivo infection and after ex vivo lung inoculation. Results showed common trends in H. parasuis gene expression under in vivo and ex vivo lung infection, such as reduced metabolism and higher expression of genes involved in nutrient acquisition, which could indicate a survival strategy under these conditions. Genes unique of virulent H. parasuis strains coding for outer membrane proteins were also detected during lung infection. These genes would require further characterization as virulent factors and could be also useful to develop new antimicrobials and vaccines. Our results also support the use of lung explants as models for pathogenicity studies of respiratory bacteria