Estudio de la fisiopatología de las alteraciones de la contractilidad in vitro del colon sigmoide en pacientes con diverticulosis

El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la fisiopatología de las alteraciones de la contractilidad in Vitro del colon sigmoide en pacientes con enfermedad diverticular asintomática (diverticulosis). Se han llevado a cabo estudios fisiológicos in vitro mediante técnicas de baño de órganos y microelectrodos, estudios histológicos e inmunohistoquímicos y de biología molecular y expresión génica (expresión relativa de mRNA - qRT-PCR) en tejido de colon sigma procedente de resecciones quirúrgicas en pacientes con y sin diverticulosis (DS). El objetivo del primer estudio, consistió en evaluar la motilidad espontánea, el potencial de membrana en reposo (RMP) y el efecto de la estimulación de las MNs inhibitorias y excitatorias en colon sigmoide humano de pacientes con DS comparado con muestras procedentes del grupo control. Además se llevaron a cabo estudios histológicos e inmunohistológicos para valorar si los cambios a nivel de motilidad in Vitro y electrofisiológicos se correlacionaban con cambios estructurales en las capas musculares, plexo mientérico o células Intersticiales de Cajal (ICCs). Nuestros resultados indican que la motilidad espontánea (contracciones rítmicas espontáneas (CRE) está muy reducida en pacientes con DS (amplitud y área bajo la curva). La respuesta a la estimulación eléctrica de campo también fue diferente en los pacientes con DS, las contracciones en ON (fruto de la estimulación de MNs excitatorias) fueron mayores (amplitud) en estos pacientes. También fueron mayores la latencia de las contracciones en OFF y el potencial post-unión inhibitorio (fruto de la estimulación de MNs inhibitorias). Las muestras de pacientes con DS también presentaron un RMP más hiperpolarizado. Sin embargo, no se observaron diferencias a nivel histológico (capas musculares, estructuras neurales y gliales del plexo mientérico, densidad de ICCs). Estos hallazgos sugieren que hay cambios fisiológicos que preceden no sólo a los síntomas sino también a los principales cambios histológicos descritos en esta enfermedad. El objetivo del segundo estudio, fue caracterizar los cambios a nivel de neurotransmisión inhibitoria observados con anterioridad. En éste confirmamos las diferencias en la motilidad in Vitro observadas previamente (disminución de la motilidad espontánea e incremento de la latencia de las contracciones) y demostramos que estas diferencias se deben fundamentalmente a un incremento de la liberación de óxido nítrico (NO), tanto espontánea, como inducida por el estímulo de MNs inhibitorias, ya que después de la incubación con L-NNA, un inhibidor de la n-NOS (enzima de síntesis del NO), la motilidad espontánea incrementó sólo en el grupo de pacientes con DS. Además hubo una reducción casi total de la latencia en ambos grupos después de adición de L-NNA. Mediante estudios moleculares detectamos un aumento de la expresión relativa de n-NOS sin cambios significativos en la expresión relativa de i-NOS, P2Y1R o en el marcador neuronal PGP9.5. Esto sugiere que las alteraciones en la vía inhibitoria en estadios iniciales se deben principalmente a un incremento en la síntesis y liberación de NO y al subsiguiente incremento de respuestas inhibitorias mediadas por NO. El tercer objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto fármacológico in Vitro de diversos espasmolíticos utilizados habitualmente en la práctica clínica para tratar las alteraciones motoras de los pacientes con enfermedad diverticular. Hemos estudiado el efecto del Bromuro de otilonio y de la N-butil-hioscina sobre las contracciones en ON. Los resultados obtenidos sugieren que aunque ambos espasmolíticos son de utilidad en estos pacientes, ambos presentan una menor eficacia y una potencia ligeramente menor en pacientes con DS. Como conclusión final, esta Tesis Doctoral pone de manifiesto que los pacientes con DS presentan una alteración de la contractilidad in vitro tanto en las contracciones espontáneas como en las inducidas por la estimulación de las motoneuronas del plexo mientérico, ya en la fase asintomática de la enfermedad. Los cambios presentes a nivel de la neurotransmisión inhibitoria son fundamentalmente de la vía nitrérgica.The aim of this Doctoral Thesis was to study the pathophysiology of the contractility alterations of the sigmoid colon, in vitro, in patients with asymptomatic diverticulosis (DS). To do this we used organ bath technique and microelectrodes, histological and immunohistochemical studies and molecular biology (mRNA relative gene expression qRT-PCR) with tissue from the human sigmoid colon of patients with and without DS undergoing surgery for colorectal cancer. The aim of the first study was to evaluate spontaneous contractility, resting membrane potential and the effect of inhibitory and excitatory enteric motor neuron stimulation, in samples from patients with DS compared with a control group. For this reason, histological and immunohistochemical studies were performed to determine whether changes observed in electrophysiologic and contractility studies in vitro correlate with structural changes in muscular layer, myenteric plexus or interstitial cells of Cajal (ICCs). Our results demonstrated that spontaneous motility (spontaneous rhythmic phasic contractions) was greatly reduced in patients with DS (amplitude and area under the curve). Electrical field stimulation (EFS), also differed between groups, and induced neurally-mediated, enhanced ON contractions (related to excitatory motor neurons - amplitude) in DS patients. EFS also increased the duration of latency of OFF contractions. The resting membrane potential of smooth muscle cells was hyperpolarized as was the amplitude of the inhibitory junction potential (related to the stimulation of inhibitory motor neurons). However, no histological differences were observed (muscular layers, neural and glial structural elements of myenteric plexus and ICCs density). These findings suggest that there are physiological changes that precede not only the symptoms but also the main histological changes described in this disease. The aim of the second study was to characterize the changes in the inhibitory neurotransmission observed previously. In this study we confirmed the differences in motility previously observed in vitro (decreased spontaneous motility and increased latency of contractions) and showed that these differences are mainly due to an increase in the release of nitric oxide (NO), both spontaneous and induced by the stimulation of inhibitory motor neurons. After incubation with L-NNA, an n-NOS inhibitor, the spontaneous motility increased only in the group of patients with DS. In addition there was an almost total reduction of latency in both groups after addition of L-NNA. Using molecular studies, we detected a relative increase in n-NOS expression without significant changes in the relative expression of i-NOS, P2Y1R or in the neuronal marker PGP9.5. This suggests that, in early stages of the disease, alterations in the inhibitory pathway are mainly due to an increase in synthesis and release of NO and the subsequent increase in inhibitory responses mediated by NO. The third aim of this doctoral thesis was to evaluate the in vitro pharmacological effect of several spasmolytic treatments commonly used in clinical practice to treat motor abnormalities in patients with diverticular disease. We studied the effect of Otilonium bromide and N-butyl-hyoscine on ON contractions. The results suggest that although both spasmolytics are useful in patients with asymptomatic diverticulosis, both show a lower efficacy and a slightly lower potency compared with controls. As a final conclusion, this doctoral thesis demonstrates that patients with diverticulosis have an in vitro contractility impairment that affects both spontaneous contractions and those induced by stimulation of the motor neurons of the myenteric plexus, present in early stages of the disease. The changes presented in inhibitory neurotransmission are primarily due to the nitrergic pathwa