Inmunomodulació de la vía Th17 con vectores virales portadores del receptor soluble de IL23: una nueva estrategia de terapia génica para el tratamiento de sclerosis múltiple

En las últimas décadas, la incidencia de enfermedades autoinmunes ha aumentado notablemente, ya sea por el mayor conocimiento, por la mejora en las herramientas de diagnóstico, o por los cambios en los hábitos de vida. Así, el incremento de afectados por este tipo de enfermedades se ha convertido en un problema social grave, pues trastornos autoinmunes crónicos como la Esclerosis Múltiple (EM) o la Enfermedad de Crohn (EC) pueden aparecer en etapas tempranas de la vida, afectando gravemente a su calidad. Más aún, los tratamientos actuales contra estas enfermedades son paliativos y frenan levemente su desarrollo, sin lograr evitar su transcurso a largo plazo, y provocando efectos secundarios graves muchas veces. Por otro lado, el coste de los medicamentos y los cuidados multidisciplinares que los pacientes requieren a lo largo de su vida constituyen un problema económico-sanitario elevado, haciendo cada vez más importante la aparición de una cura eficaz. La EC es una enfermedad inflamatoria intestinal grave que afecta especialmente al colon y al íleo, además de tener otras complicaciones sistémicas y extraintestinales. Por su parte, la EM es una enfermedad desmielinizante que afecta al SNC provocando una pérdida progresiva de la movilidad y otras complicaciones secundarias. En ambas enfermedades juega un papel muy importante la vía Th17, y por consiguiente, la IL23. De hecho, algunos tratamientos experimentales para ambas tratan de inhibir la función de IL23 mediante el uso de anticuerpos, con resultados controvertidos. Así pues, en este trabajo nos propusimos estudiar una estrategia de terapia génica no basada en el uso de anticuerpos, sino en un vector viral portador de IL23R soluble (IL23Rs), que se uniera a IL23 y redujera su acción. En la primera parte, nos centramos en la EC y en la obtención del vector viral idóneo para terapia intestinal. El adenovirus quimera Ad5/40S, con un marcado tropismo intestinal cumple estos requisitos. Sin embargo, su producción in vitro era muy ineficiente, por lo que se desarrolló un método optimizado de producción, basado en el uso de células 211B en suspensión y polybrene durante las infecciones en el proceso de amplificación viral. Por otra parte, también se realizaron dos estudios de tropismo con diferentes vectores virales: in vitro en linfocitos T CD4+, demostrando que el Ad5/40S es el vector que mejor infecta, e in vivo, estudiando el tropismo celular en intestino y demostrando que ninguno de los vectores virales infecta eficientemente las stem cells de las criptas de Lieberkühn. Debido a que no obtuvimos un perfil Th17 en el modelo de colitis inducida por DSS, en la segunda parte del trabajo nos centramos en la EM. Primeramente, se diseñó el IL23Rs murino, que fue clonado en diferentes vectores virales. Seguidamente, se demostró que células infectadas con estos vectores secretaban IL23Rs al exterior celular y que IL23Rs se unía a IL23 in vitro. Finalmente, los vectores portadores de IL23Rs se probaron en un modelo murino de EM, la Encefalomielitis Autoinmune Experimental. Los resultados expuestos en este trabajo indican que la expresión de IL23Rs tiene un efecto beneficioso en la evolución clínica de la enfermedad, retrasando la aparición de los primeros síntomas y reduciendo la gravedad de los mismos hasta el final del seguimiento clínico. Asimismo, en concordancia con la mejora clínica observada, los ratones tratados no presentan evidencias de desmielinización, además de tener una menor inflamación y una respuesta astroglial y microglial significativamente menor en médula espinal. En resumen, nuestros resultados sugieren que el empleo de una terapia génica inmunomoduladora para EM basada en el uso de vectores virales portadores de IL23Rs podría tener un efecto terapéutico en el desarrollo de la enfermedad.In the last decades, the incidence of autoimmune diseases has increased significantly, either by the greater knowledge we have of them, by the improvement of diagnostic tools, or by changes in lifestyle. Indeed, the increase of patients affected by these diseases has become a serious social problem since chronic autoimmune disorders like Multiple Sclerosis (MS) or Crohn's Disease (CD) appear early in the lives of patients, affecting seriously their quality of life. Moreover, current treatments for these diseases fail to prevent therapeutic effect at long term and cause serious side effects in many cases; despite they slightly alleviate the symptoms and delay the development of the disease. In addition, the cost of drugs and multidisciplinary care that patients require throughout their life are high economic-health problems. Thus, the development of an effective cure for these diseases has become very important. CD is a severe inflammatory bowel disease affecting colon and ileum, but also other systemic and non-intestinal complications. On the other hand, MS is a demyelinating disease of the central nervous system that causes a progressive loss of mobility and many other systemic symptoms and secondary complications. In both autoimmune diseases the Th17 pathway plays an important role, and therefore the IL23 as well. In fact, the rationale of some experimental treatments for both diseases is based on inhibiting the function of IL23 using antibodies, but unfortunately the reported results are controversial. Thus, in this work we have studied a gene therapy strategy not based on the use of antibodies, but on a viral vector carrying a soluble form of IL23R, which binds the IL23 in order to reduce its action. In the first part of this work we focused on CD and in the generation of an appropriate viral vector for intestinal therapy. The chimeric adenovirus Ad5/40S with marked intestinal tropism is a good candidate vector for this purpose. However, the in vitro production of the Ad5/40S was very inefficient, so an optimized production method was developed. The new method was based on the use of suspension cells 211BS and polybrene during infections in the viral amplification process. Moreover, a tropism study was conducted with CD4+ T lymphocytes, demonstrating that the Ad5/40S is the vector infecting these cells with the highest efficiency. A study of the intestinal cell tropism in vivo of different viral vectors was also performed, showing that none of them infects stem cells in the crypts of Lieberkühn. In the second part of this work we focused on MS. First, we designed the soluble form of murine IL23R (IL23Rs), which was cloned in different viral vectors. Subsequently, it was demonstrated that cells infected with these viruses secreted IL23Rs to the extracellular medium. It was also demonstrated that IL23Rs is able to bind to IL23 in vitro. Finally, vectors carrying IL23Rs were tested in the mouse model of MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. After several approaches, we demonstrated that expression of IL23Rs has a positive effect on the clinical course of the disease, delaying the time of onset and reducing the severity of symptoms until the end of the experiment. In agreement with the clinical improvement observed, treated mice have a reduced inflammatory response, a significantly lower astroglial and microglial activation as well as an absence of demyelinating signs in spinal cord. In summary, our results suggest that the use of an immunomodulatory gene therapy for multiple sclerosis based on the use of viral vectors carrying IL23Rs could have a therapeutic effect in the development of the disease